蛋白质的检测、鉴定及回收

检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝R－250（CBB，Coomassie brilliant blue），通常是用甲醇：水：冰醋酸（体积比为45：45：10）配制0.1％或0.25％（W/V）的考马斯亮蓝溶液作为染色液。这种酸－甲醇溶液使蛋白质变性，固定在凝胶中，防止蛋白质在染色过程中在凝胶内扩散，通常染色需2小时。脱色液是同样的酸－甲醇混合物，但不含染色剂，脱色通常需过夜摇晃进行。考马斯亮蓝染色具有很高的灵敏度，在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到0.1 g的蛋白质形成的染色带。考马斯亮蓝与某些纸介质结合非常紧密，所以不能用于染色滤纸、醋酸纤维素薄膜以及蛋白质印迹（在硝化纤维素纸上）。在这种情况下通常是用10％的三氯乙酸浸泡使蛋白质变性，而后使用不对介质有强烈染色的染料如溴酚蓝、氨基黑等对蛋白质进行染色。

银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法，它是通过银离子（Ag+）在蛋白质上被还原成金属银形成黑色来指示蛋白区带的。银染可以直接进行也可以在考马斯亮蓝染色后进行，这样凝胶主要的蛋白带可以通过考马斯亮蓝染色分辨，而细小的考马斯亮蓝染色检测不到的蛋白带由银染检测。银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，可以检测低于1 ng的蛋白质。

糖蛋白通常使用过碘酸－Schiff试剂（PAS）染色，但PAS染色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的红－粉红带，难以在凝胶中观察。目前更灵敏的方法是将凝胶印迹后（下面介绍）用凝集素检测糖蛋白。凝集素是从植物中提取的一类糖蛋白，它们能识别并选择性的结合特殊的糖，不同的凝集素可以结合不同的糖。将凝胶印迹用凝集素处理，再用连接辣根过氧化物酶的抗凝集素抗体处理，然后再加入过氧化物酶的底物，通过生成有颜色的产物就可以检测到凝集素结合情况。这样凝胶印迹用不同的凝集素检测不仅可以确定糖蛋白，而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。

通过扫描光密度仪对染色的凝胶进行扫描可以进行定量分析，确定样品中不同蛋白质的相对含量。扫描仪测定凝胶上不同迁移距离的吸光度值，各个染色的蛋白带形成对应的峰，峰面积的大小可以代表蛋白质的含量的多少。另外一种简单的方法是将染色的蛋白带切下来，在一定体积的50％吡啶溶液中摇晃过夜溶解染料，而后通过分光光度计测定吸光度值就可以估算蛋白质的含量。但应注意，蛋白质只有在一定的浓度范围内其含量才与吸光度值成线性关系，另外不同的蛋白质即使在含量相同的情况下染色程度也可能有所不同，所以上面的方法对蛋白质含量的测定只能是一种半定量的结果。

尽管凝胶电泳通常是作为一种分析工具使用，它也可以用于蛋白质的纯化制备。但电泳后需将蛋白质从凝胶中回收，通常是将所需的蛋白质区带部分的凝胶切下，通过电泳的方法将蛋白质从凝胶中洗脱下来（称为电洗脱）。目前有各种商品电洗脱池装置。最简单的方法是将切下的凝胶装入透析袋内加入缓冲液浸泡，再将透析袋浸入缓冲液中进行电泳，蛋白质就会向某个电极方向迁移而离开凝胶进入透析袋内的缓冲液。由于蛋白质不能通过透析袋，所以电泳后蛋白质就留在透析袋的缓冲液中。电洗脱后可通一个反向电流，持续几秒钟，使吸附在透析袋上的蛋白质进入缓冲液，这样就可以将凝胶中的蛋白质回收。