等电聚焦电泳

等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。等电聚焦的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。

两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基－多羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的pH梯度范围，既有较宽的范围如pH＝3～10，也有各种较窄的范围如pH＝7～8。要根据待分离样品的情况选择适当的两性电解质，使待分离样品中各个组分都在两性电解质的pH范围内，两性电解质的pH范围越小，分辨率越高。

等电聚焦多采用水平平板电泳，也使用管式电泳。由于两性电解质的价格昂贵，使用1～2 mm厚的凝胶进行等电聚焦价格较高。使用两条很薄的胶带做为玻璃板间隔，可以形成厚度仅0.15 mm的薄层凝胶，大大降低成本，所以等电聚焦通常使用这种薄层凝胶。由于等电聚焦过程需要蛋白质根据其电荷性质在电场中自由迁移，通常使用较低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（如4％）以防止分子筛作用，也经常使用琼脂糖，尤其是对于分子量很大的蛋白质。制作等电聚焦薄层凝胶时，首先将两性电解质、核黄素与丙烯酰胺贮液混合，加入到带有间隔胶条的玻璃板上，而后在上面加上另一块玻璃板，形成平板薄层凝胶。经过光照聚合后，将一块玻璃板橇开移去，将一小薄片湿滤纸分别置于凝胶两侧，连接凝胶和电极液（阳极为酸性如磷酸溶液，阴极为碱性如氢氧化钠溶液）。接通电源，两性电解质中不同的等电点的物质通过电泳在凝胶中形成pH梯度，从阳极侧到阴极侧pH值由低到高呈线性梯度分布。而后关闭电源，上样时取一小块滤纸吸附样品后放置在凝胶上，通电30 min后样品通过电泳离开滤纸加入凝胶中，这时可以去掉滤纸。最初样品中蛋白质所带的电荷取决于放置样品处凝胶的pH值，等电点在pH值以上的蛋白质带正电，在电场的作用下向阴极移动，在迁移过程中，蛋白质所处的凝胶的pH值逐渐升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，到达pH＝pI处的凝胶区域时蛋白质不带电荷，停止迁移。同样，等电点在上样处凝胶pH以下的蛋白质带负电，向阳极移动，最终到达pH＝pI处的凝胶区域停止。可见等电聚焦过程无论样品加在凝胶上什么位置，各种蛋白质都能向着其等电点处移动，并最终到达其等电点处，对最后的电泳结果没有影响。所以有时样品可以在制胶前直接加入到凝胶溶液中。使用较高的电压（如2000V，0.5mm平板凝胶）可以得到较快速的分离（0.5～1小时），但应注意对凝胶的冷却以及使用恒定功率的电源。凝胶结束后对蛋白质进行染色时应注意，由于两性电解质也会被染色，使整个凝胶都被染色。所以等电聚焦的凝胶不能直接染色，要首先经过10％的三氯乙酸的浸泡以除去两性电解质后才能进行染色。

等电聚焦还可以用于测定某个未知蛋白质的等电点，将一系列已知等电点的标准蛋白（通常pI在3.5～10之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离对各自的pI值作图，即得到标准曲线。而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求出其等电点。

等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋白质微观不均一性，例如一种蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，而在等电聚焦中表现三条带。这可能是由于蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的分子量产生明显的影响，因此在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等电聚焦中可以被分离检测到。同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。由于等电聚焦过程中蛋白质通常是处于天然状态的，所以可以通过前面介绍的活性染色的方法对酶进行检测。等电聚焦主要用于分离分析，但也可以用于纯化制备。虽然成本较高，但操作简单、纯化效率很高。除了通常的方法，制备性等电聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或颗粒状凝胶如Sephadex G-75中进行。