KRAS抑制剂筛选---核苷酸交换法

2023-07-03 15:47 作者:BPSbioscience 0人读过 | 我要投稿

01背景

RAS属于一类小 GTP酶家族。像大多数小 GTP酶一样，KRAS在其非活性形式中结合 GDP，在其活性形式中结合 GTP。鸟嘌呤酸交换因子（GEFs）如 SOS和 gp120 GAP（GTP酶激活蛋白）促进核苷酸交换。gp120 GAP催化 Ras/GTP 中的 GTP 水解为 GDP，从而使 RAS 失活，而 SOS 促进 GDP 与 GTP 的交换并激活 RAS。

RAS家族主要由KRAS、NRAS 和 HRAS 这三个成员组成，它们是人类肿瘤中癌基因家族最常见的突变。其中，30%的肿瘤出现RAS突变。KRAS 是最主要的突变形式（85%），而NRAS和HRAS则较少见（分别为11%和4%）。

超过70%的RAS突变发生在RAS蛋白的G12、G13或Q61位置。10年前，KRAS 被认为是“不可成药靶点”。但是，Ostrem等人[PMID：24256730]通过共价靶向突变特异性游离半胱氨酸残基的方法打开了KRAS成药之门。G12C 突变有利于维持 KRAS 的活化（GTP结合）状态，增强了导致肿瘤发生的信号。KRAS（G12C）存在于结肠癌和肺癌中，并成为一个有吸引力的治疗靶点。

现在已经开发出两种抑制剂，通过将 KRAS（G12C）锁定在其非活性形式来阻断 KRAS（G12C）介导的信号传导。这两种KRAS（G12C）抑制剂的推动了该领域的发展。由于RAS突变在人类肿瘤中的高频率以及RAS相关肿瘤的有限的治疗方案，对KRAS的研究依然非常火热。

药物发现和开发项目需要可靠的检测方法来筛选和评估潜在抑制RAS异构体的小分子化合物。BPS Bioscience主要提供两种高通量筛选方法。一种是基于AlphaScreen®技术，另一种是利用BODIPY®-GDP荧光标记的GDP/GTP交换检测试剂盒。

02纯化蛋白

KRAS检测的质量很大程度上取决于蛋白质的质量。我们使用His-Tag对野生型和突变型对蛋白进行纯化。纯化的蛋白质根据应用加载了GDP、不可水解的GTP类似物GppNHp或BODIPY-GDP。我们也提供纯化的NRAS(Q61H)、NRAS(Q61L)和NRAS(Q61K)。

左图：通过4-20% SDS-PAGE电泳检测gp120GAP的纯度。

右图：使用不同浓度的p120GAP和2μM GTP，对KRAS-WT（50ng）和KRAS-G12C（100ng）的GTP酶活性进行测试。

KRAS调控因子gp120GAP蛋白含有RAS-GAP功能域和N-末端的His-Tag。其通过促进GTP替换成GDP使KRAS失活。另一方面，SOS1用于通过促进GDP替换成GTP激活KRAS。SOS1重组蛋白包含KRAS结合域和功能域。

03 KRAS Nucleotide Exchange Assay Kit

KRAS核苷酸交换检测试剂盒是一种均相检测方法，其利用荧光标记的BODIPY®-GDP监测核苷酸交换来筛选和评估KRAS抑制剂。加入过量的EDTA和GTP推动反应向活化的GTP-KRAS形式转化。KRAS抑制剂通过将GDP-KRAS锁定在其非活性、结合GDP的构象中，阻断了核苷酸交换。

该检测方法针对两种不同的优化方案，以提供更大的灵活性。一种是在固定的GTP浓度下逐渐滴定抑制剂，另一种是在固定的抑制剂浓度下逐渐滴定GTP。

BODIPY®FL-GDP是一种混合异构体，荧光染料通过连接基团与核糖环的2'或3'位置连接而成。它是一种绿色荧光染料，具有类似于荧光素或Alexa Fluor™ 488的激发和发射特性，具有高消光系数和高量子产率，并对pH变化相对不敏感。该染料的激发态寿命为5纳秒或更长。

BODIPY-GDP负载的KRAS在室温下与不同浓度的测试化合物预孵育2小时。在室温下，加入GTP（1μM）和EDTA（25mM）反应1小时。读取荧光信号（Ex470nm/Em525nm）。

负载BODIPY-GDP的KRAS（G12C）在室温下与浓度为10μM的测试化合物（AMG510）预孵育2小时。添加不同浓度的GTP后，添加25m EDTA启动反应，并在室温下孵育1小时。读取荧光信号（Ex470nm/Em525nm）。

使用KRAS核苷酸交换检测方案测量已经加载BODIPY-GDP的KRAS蛋白加入蛋白质活性，GTP浓度从0-100μM逐渐滴定（左侧）。蛋白质纯度通过4-20% SDS-PAGE电泳后进行Coomassie染色评估（右侧）。

04 KRAS(G12C) Coupled Nucleotide Exchange Assay Kit

负载GDP的KRAS处于非活性状态，不与下游效应子RAF1（丝氨酸/苏氨酸激酶c-Raf）相互作用。KRAS(G12C)耦联核苷酸交换检测利用SOS介导的核苷酸交换来激活与GDP结合的KRAS(G12C)。蛋白质SOS1是一种鸟苷酸交换因子，它通过促使激活的生长因子受体招募SOS1，造成GDP从KRAS中释放，使GTP能够占据核苷酸结合口袋，从而促进核苷酸交换。这导致KRAS的构象变化，使其能够与RAF1的RBD域（Ras结合域）结合，进而引发促进生长的信号级联反应。

原理：均相AlphaLISA®检测

KRAS(G12C)耦联核苷酸交换检测（BPS Bioscience #78004）使用纯化的带有GST标签的RBD-RAF和带有His标签的KRAS(G12C)在AlphaLISA®方法中监测KRAS(G12C)与RBD-RAF的结合。谷胱甘肽受体珠和镍螯合供体珠通过与GST标记的RBD-RAF和His标记的KRAS(G12C)结合，使其能够在激光激发后发生能量传递。因此，当KRAS(G12C)与RAF1形成复合物时，供体珠将荧光激发能量传递给受体珠。如果没有形成复合物，则不会发生能量传递。

方法

• 将非活性的GDP-KRAS(G12C)预先与待测的抑制剂在检测缓冲液中孵育。

• 加入纯化的SOS1和过量的GTP，并孵育反应30分钟。

• 加入纯化的RAF1的RBD结构域，孵育反应30分钟。

• 加入谷胱甘肽受体珠（PerkinElmer #AL109C）和镍螯合供体珠（PerkinElmer #AS101D），孵育反应30分钟。

• 使用兼容的Alpha®酶标仪读板。