法 第12部分：微生物指标》标准菌株特性研究

GB/T 5750.12 -2023《生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》已于近日发布，将于10月1日实施。与之前版本相比，新增肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌2个检测指标、3种检测方法，增加了菌落总数酶底物方法，同时对新增方法强化了培养基检验和阳性/阴性对照要求，肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌检测指标增加4株标准菌株。CICC对标准中规定的阳性及阴性标准菌株进行了关键生化特性验证，并开发定量工作菌株和标准样品产品，满足检测实验室的新方法验证和质量控制需求。

标准菌株/标准样品推荐列表

标准菌株典型特性

一、菌落总数酶底物法

1. 复合酶底物培养基36±1 ℃下培养48 h

在366 nm紫外灯照射下呈现蓝色荧光。

二、肠球菌（多管发酵法）

1. 肠球菌肉汤于35 ℃±2 ℃培养24 h

左：呈现明显黑色沉淀；

右：未生长，无明显黑色沉淀。

2. 肠球菌琼脂平板于35 ℃±2 ℃培养24 h

左：菌落棕黑色且有棕黑色菌环；

右：未生长。

3. BHIB肉汤于35 ℃±0.5 ℃培养24 h

左：肉汤浑浊，生长良好；

右：肉汤浑浊，生长良好。

4. BHIA琼脂平板于35 ℃±0.5 ℃培养48 h

左：菌落浅黄色，圆形；

右：菌落黄色，圆形。

5. BEA琼脂平板于35 ℃±0.5 ℃培养48 h

左：分解培养基中的七叶苷，形成棕色沉淀；

右：分解培养基中的七叶苷，形成棕色沉淀。

6. 6.5%氯化钠BHIB肉汤于35 ℃±0.5 ℃培养48 h

左：浑浊，生长良好；

右：不生长。

7. BHIB肉汤于45 ℃±0.5 ℃培养48 h

8.染色镜检

左：菌体椭球状，单个、成对或呈短链状排列，革兰氏阳性；

右：菌体短杆状，单个或成对排列，革兰氏阴性。

三、肠球菌（滤膜法）

1. CATC琼脂平板于35 ℃±2 ℃培养48 h

左：生长良好，菌落红色；

右：不生长。

四、产气荚膜梭状芽孢杆菌（滤膜法）

1. SPS平板于36 ℃±1 ℃ 厌氧培养24 h

2. 染色镜检

左：菌体杆状，单个、成对或呈短链状排列，革兰氏阳性；

右：菌体杆状，单个或成对排列，革兰氏阳性。

3. 含铁牛乳培养基于46 ℃±1 ℃水浴培养2 h

左：爆裂发酵，阳性；

右：未发酵，阴性。

4. 缓冲动力-硝酸盐培养基于36 ℃±1 ℃厌氧培养24 h

左：沿穿刺线生长，动力阴性；能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，阳性；

右：沿穿刺线生长，动力阴性；加锌粉颜色变红，不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，阴性。

5. 卵黄琼脂平板于36 ℃±1 ℃厌氧培养24 h

左：接种点底部及周围形成乳白色的浑浊带，阳性；

右：无白色浑浊带，阴性。

质量控制

新标准对菌落总数酶底物法、肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌等新增检测方法要求采用标准样品或一定浓度的菌悬液进行质量控制。其中：

菌落总数酶底物法

可选用有证菌落总数质控标样进行阳性对照和培养基检验。

肠球菌多管发酵法

培养基检验要求阳性菌株制成浓度为10 CFU/mL～100 CFU/mL，阴性菌株制成浓度为1000 CFU/mL~5 000 CFU/mL。

对照试验要求阳性菌株和阴性菌株制成浓度为100 CFU/100 mL~1 000 CFU/100 mL的菌悬液。

肠球菌滤膜法

培养基检验及对照试验均要求将阳性菌株和阴性菌株制成浓度为10 CFU/100 mL~100 CFU/100 mL的菌悬液。

产气荚膜梭状芽孢杆菌滤膜法

培养基检验及对照试验均要求将阳性菌株和阴性菌株制成浓度为5 CFU/100 mL~100 CFU/100 mL的菌悬液。

为简化实验室菌悬液制备流程，CICC提供定量标准菌株产品。同时，建议实验室使用质控样品进行新方法验证。相关产品目录见表2。

更多检测项目推荐产品见表3。

附件：http://www.china-cicc.org/upload/file/20230412/1e3b4495f82144adb284b67ad79f7e9e.pdf