USP16介导的钙调磷酸酶A去泛素化控制外周 T细胞稳态维持

写在前面

        今天推荐的是由浙江大学生命科学研究所在2019年5月28日发表于The Journal of Clinical Investigation（2020IF：14.808，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Jin Jin教授，研究表明USP16介导的钙调磷酸酶A去泛素化控制外周 T细胞稳态维持。

研究背景

        钙调神经磷酸酶作为一种钙激活的磷酸酶，使各种底物去磷酸化，以触发它们的核易位和转录活性。然而，调节NFAT募集到钙调神经磷酸酶的详细机制仍然知之甚少。

摘要部分

        在这里，作者报告了由PPP3CB或PPP3CC编码的钙调神经磷酸酶A(CNA)在赖氨酸327上组成性泛素化，并且该多泛素链被泛素羧基末端水解酶16(USP16)迅速去除以响应细胞内钙刺激。CNA的K29连接泛素化会损害NFAT募集和NFAT靶向基因的转录。USP16缺乏以与外周T细胞的稳态维持和增殖缺陷的方式阻止了钙触发的CNA去泛素化。T细胞特异性USP16敲除小鼠表现出自身免疫性脑炎和炎症性肠病的严重程度降低。作者的数据揭示了CNA泛素化及其去泛素化酶USP16在外周T细胞中的生理功能。值得注意的是，作者的结果突出了调节钙调神经磷酸酶活性的关键机制和治疗自身免疫性疾病的新型免疫抑制药物靶点。

研究内容

1.非蛋白水解泛素化抑制钙调神经磷酸酶活性和NFAT募集     

        已知钙调神经磷酸酶参与 T细胞活化和钙依赖性信号转导。然而，指示钙调神经磷酸酶激活的详细机制和修饰仍然知之甚少。有趣的是，作者的研究结果表明，在小鼠原代CD4+ T细胞中，CNA的催化亚基在TCR或PMA/离子霉素(P/I)刺激下迅速去泛素化，而蛋白质水平没有变化。一致地，从健康供体的外周血单核细胞(PBMC)获得的人类CD4+ T细胞在P/I刺激5分钟后表现出类似的CNA去泛素化。钙调神经磷酸酶是调节亚基CNB和催化亚基CNA的异二聚体，可由PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC中的任何一个编码。在3CB中，作者发现当第326-351位的氨基酸被删除时，多泛素化水平显着降低。这些结果表明潜在的泛素化位点位于残基326-351。作者在该片段中仅鉴定了2个赖氨酸残基K327和K332。为了确认CNA的泛素化位点，作者从原代CD4+ T细胞中分离了CNA，质谱分析显示K61和K327被泛素化。这些数据支持作者的结论，即泛素化是CNA避免其自动激活的关键过程。

        为了进一步研究CNA在这些特定赖氨酸残基上的功能意义，作者将赖氨酸残基替换为精氨酸残基(R)以生成CNA点突变体。K327R突变导致片段失去多泛素化能力。与从3CB获得的发现一致，3CA或3CC在该保守赖氨酸残基处的突变也导致泛素化水平降低。3CB的NMR结构显示K327位于疏水口袋内，该口袋与NFAT的短线性基序(PxIxIT)结合。因此，作者假设CNA泛素化可能涉及其与底物的相互作用。共免疫沉淀(coIP)分析表明，CNA泛素化缺陷导致NFAT2募集增加。这些数据表明K327处的CNA去泛素化对于活化 T细胞中的NFAT募集至关重要。

研究结论：T细胞活化与钙调磷酸酶A的去泛素化有关。

2.USP16选择性地与由PPP3CB和PPP3CC编码的CNA相关联     

        为了确定调节CNA去泛素化的潜在DUB，作者筛选了CNA和HEK293 T细胞中46个单独DUB之间的相互作用。coIP结果表明，只有异位USP16与内源性CNA相关。如之前的研究所示，人类USP16中的半胱氨酸205是其催化活性所必需的。转染WT USP16，而不是催化失活的USP16 C205S突变体（USP16-CI）导致CD4+ T细胞中更高的P/I诱导的NFAT活性，如NFAT荧光素酶报告基因检测所示。在没有刺激的情况下，coIP结果显示内源性USP16和CNA之间没有相互作用，而TCR连接迅速诱导USP16与CNA结合。通过共聚焦显微镜，作者发现在静息CD4+ T细胞中，USP16主要位于细胞核中并与胞质CNA分离。TCR刺激3小时后，在细胞质中观察到USP16与CNA的显着共定位。作者首先证明USP16与PPP3CA无明显关联，随后发现过表达的USP16与3CB或3CC在HEK293 T细胞的关联。共聚焦图像显示，在没有刺激的情况下，转染的USP16主要分布在细胞质中。所有这些数据表明，P/I或TCR触发的USP16从细胞核到细胞质的易位对于其在 T细胞活化过程中与CNA的结合是必不可少的。

        USP16包含一个肽酶域和一个锌指泛素结合域(Znf-Ubp)。使用HEK293 T细胞的co-IP结果显示CNA和USP16之间的关联依赖于CNA的催化域和USP16的肽酶域。作者还确定了5个连续的氨基酸,TMIEV，它们在3CB和3CC之间是保守的，但在3CA中不存在。如果删除了这5个氨基酸，则在USP16和3CBΔ86-91之间没有检测到关联。

研究结论：TCR参与触发USP16在活化的T细胞中与3CB或3CC的选择性结合。

3.USP16选择性去除了CNA的K29连接的多聚泛素链     

        为了表征USP16的DUB活性，作者分析了在HEK293 T细胞中与USP16共转染后CNA的泛素化水平。结果表明，USP16-WT而非USP16-CI可以去泛素化3CB和3CC。体外去泛素化分析还表明USP16介导的3CB去泛素化需要其DUB活性，因为USP16-CI突变体未能去泛素化3CB。作者进一步发现USP16从3CB中选择性地去除了K29连接的多聚泛素链，相反地增加了K33和K63连接的泛素化。

        为了进一步证实USP16在内源性CNA去泛素化中的关键作用，作者生成了USP16fl小鼠，并将它们与Cd4-Cre小鼠杂交以敲除T细胞中的USP16。IB分析揭示了USP16-KO T细胞中USP16表达的缺陷。此外，TCR刺激不影响早期WT T细胞中USP16的蛋白质水平。尽管未检测到对CNA和CaM的蛋白质水平产生影响，但USP16缺乏部分抑制了由TCR刺激触发的CNA去泛素化。然后，作者用编码WT或无催化活性形式的USP16的逆转录病毒载体转染USP16缺陷型CD4+ T细胞。数据表明USP16-WT而非USP16-CI突变体可以促进TCR刺激期间CNA的去泛素化。

研究结论：USP16选择性去除了CNA的K29连接的多聚泛素链。

4.USP16介导的CNA去泛素化对于NFAT激活是必不可少的     

        为了阐明USP16介导的CNA在活化 T细胞中去泛素化的潜在机制，作者首先评估了P/I或TCR诱导的关键信号事件。USP16缺陷型CD4+ T细胞显示出相当的MAP激酶磷酸化激活水平和典型NF-κB激活水平。随后作者评估了原代CD4+ T细胞中的Ca2+通量。FACS分析表明USP16缺乏不会导致上游Ca2+通量受损。与先前的结果一致，USP16缺陷型CD4+ T细胞显示出受TCR或P/I刺激的NFAT1和NFAT2的活化和核易位减少，这导致NFAT靶向细胞因子的诱导减少。

        在重建的USP16缺陷型CD4+ T细胞中，USP16-WT而非USP16-CI挽救了NFAT2的缺陷激活。总的来说，这些发现表明，在不影响其他关键信号级联的情况下，USP16是激活NFAT所特别需要的。为了进一步证实USP16在调节NFAT激活中的作用，作者检查了内源性CNA与CaM或NFAT2的分子相互作用。USP16介导的CNA去泛素化对于其与CaM的相互作用是可有可无的。相反，USP16缺乏完全破坏了TCR触发的NFAT2向CNA的募集。为了阐明CNA泛素化与NFAT2激活之间的联系，作者用WT(3CB-WT)或K327R突变体3CB(3CB-M)表达构建体重建了鼠T细胞系EL4，然后使用USP16特异性shRNA敲低USP16表达。与在USP16缺陷型CD4+ T细胞中观察到的类似，USP16沉默抑制了NFAT2向3CB-WT而非3CB-M的募集。因此，USP16似乎是通过调节NFAT募集和激活来调节CNA活性的关键。

研究结论：USP16介导的CNA去泛素化对于NFAT激活是必不可少的。

5.USP16缺乏导致外周T细胞稳态维持受损

        作为钙调神经磷酸酶的重要调节剂，发现USP16主要分布在免疫组织。USP16的mRNA和蛋白质水平分析还表明，USP16在不同的免疫细胞中均匀表达。然而，USP16-KO小鼠脾脏和外周淋巴结中的T细胞数量明显减少，而CD4+与CD8+ T细胞的比例没有变化。出乎意料的是，FACS分析表明双阴性（DN）、双阳性（DP）和单阳性（SP）CD4+和CD8+胸腺细胞的比例相当，这表明USP16不参与T胸腺中的细胞发育。为了阐明USP16对胸腺细胞和外周T细胞的差异调节，作者评估了这些组织中3CA、3CB和3CC的表达水平。这些酶的qPCR分析显示3CA主要在胸腺细胞中表达，而3CC主要分布在脾脏或淋巴结的外周 T细胞中。因为3CA不结合USP16，USP16缺陷胸腺细胞在P/I刺激后表现出相当的NFAT2核水平。这些结果表明USP16仅用于维持外周T细胞，而不是胸腺细胞的发育。另一方面，作者发现USP16-KO小鼠的外周记忆 T细胞频率显着降低。为了进一步研究USP16在T细胞中的内在作用，作者将USP16-KO小鼠（CD45.2+）和WT B6.SJL小鼠（CD45.1+）的BM细胞转移到RAG1缺失的小鼠体内，产生了骨髓（BM）嵌合小鼠。两个月后，FACS分析显示这些嵌合小鼠中CD45.1+和CD45.2+胸腺细胞的水平相当，USP16缺陷型CD45.2+细胞在脾脏中产生的成熟T细胞比例显着降低。总之，USP16通过细胞内在机制介导外周 T细胞稳态维持和体内平衡。

研究结论：USP16缺乏导致外周T细胞稳态维持受损。

6.USP16对T细胞活化和增殖至关重要

        为了阐明USP16在调节T细胞活化中的详细机制，作者首先证明USP16对成熟T细胞从胸腺到外周器官是不需要的。众所周知，外周T细胞通过TCR介导的细胞分裂进行自我更新。因此，作者评估了用针对CD3和CD28的激动性抗体刺激的初始WT和USP16缺陷型CD4+ T细胞的增殖能力。CFSE标记的USP16缺陷T细胞未能增殖，如CFSE强度没有降低所示。只有WT USP16恢复了USP16缺陷型CD4+ T细胞的增殖能力，表明USP16的催化活性对T细胞增殖至关重要。BrdU掺入分析表明，来自USP16-KO小鼠的外周 T细胞无法在体内和体外进入细胞周期。与增殖缺陷一致，原代的USP16缺陷型CD4+ T细胞在体外完全无法极化为Th1和Th17细胞。一致地，USP16缺乏导致Th2极化受损，并表明USP16缺陷T细胞可能在免疫反应期间失去其生理功能。作者之前的结果表明，USP16通过控制NFAT激活来调节T细胞增殖。因此，作者用NFAT2的逆转录病毒载体重建了WT和USP16缺陷的T细胞， NFAT2显着恢复了USP16缺陷T细胞的增殖能力至其WT控制水平。

 研究结论：USP16对T细胞活化和增殖至关重要。

7.USP16缺乏可减轻T细胞介导的自身免疫性疾病     

        鉴于USP16在 T细胞介导的炎症中的潜在重要性，作者首先分析了USP16在从健康个体或炎症性肠病(IBD)患者收集的肠组织中的表达。在健康对照中，USP16主要存在于肠上皮细胞中。相反，炎症条件引发结肠浸润CD4+ T细胞中USP16表达的增加。然后作者评估了自身免疫性疾病患者PBMC中USP16的mRNA水平。IBD患者的USP16 mRNA水平明显高于健康对照个体。     

        目前的证据表明 T细胞对IBD的发病机制有重要贡献。为了确认病理性T细胞中USP16的表达，作者接下来检查了从健康供体或IBD患者的外周血中分离的CD4+ T细胞中USP16的mRNA水平。统计分析显示，来自CD而非UC患者的CD4+ T细胞中USP16的表达增加。一致地，CD4+ T细胞中USP16 mRNA水平较高的患者具有显着较高的CD活性指数。

        为了评估USP16在炎症性疾病中的体内功能，作者通过转移效应 T细胞建立了结肠炎模型。将来自USP16-KO小鼠的原代CD45RBhi CD4+ T细胞转移到RAG1–/–小鼠中，与对照相比，并没有诱导体重减轻或炎症引发的死亡。一致地，USP16缺陷 T细胞不会导致结肠长度缩短或上皮剥脱。在脾脏和肠系膜淋巴结(mLN)中也检测到USP16缺陷T细胞的百分比降低。

         为了进一步检查USP16在T细胞介导的炎症中的作用，作者评估了USP16在其他自身免疫性疾病中的表达，包括多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)。qPCR分析和公共数据集显示，与健康供体相比，MS或SLE患者的CD3+ T细胞中USP16的表达更高。另一方面，采用自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的T细胞依赖性自身免疫疾病模型，作者发现 USP16-KO小鼠表现出明显延迟的EAE发作和中枢神经系统浸润水平显着降低。在脊髓中，USP16-KO小鼠在浸润性T细胞方面表现出严重缺陷，并且骨髓细胞(CD11b+ CD45hi)中度增加。一致地，USP16缺陷T细胞在MOG肽的反应中表现出严重缺陷，这导致WT T细胞的强烈增殖。此外，在用MOG肽刺激后，来自EAE的USP16-KO小鼠的外周 T细胞产生的炎性细胞因子水平明显降低。

 研究结论：这些结果表明USP16是成熟T细胞增殖和T细胞介导的自身免疫疾病所必需的

结论与讨论

        本研究数据表明，来自不同自身免疫性疾病患者的外周CD4+T细胞显示出USP16的水平升高。作者进一步阐明USP16在活化的T细胞中作为CNA的DUB发挥作用，USP16的缺乏导致钙神经蛋白活性受损。在TCR刺激下， USP16被招募到CNA上，并选择性地去除3CB和3CC上的K29连接的聚泛素链。T细胞特异性USP16基因敲除小鼠表现出严重的外周T细胞数量减少，同时自身免疫症状减弱。表明USP16可能成为治疗T细胞介导的自身免疫性疾病的新的治疗靶标。

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原文链接:https://www.jci.org/articles/view/123801