病毒（细胞）RNA的提取

一、实验材料

微量移液器（1mL、200μL），DEPC水处理过的枪头/EP管，Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用DEPC水配制）

二、实验原理

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-15μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。Trizol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了β-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

三、实验方法

1. 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，24孔板每孔加1 ml，用移液器吸打几次。

2. 1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，冰浴10 min。(注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行，使其充分混匀。)

3. 4℃ 12000 rpm离心5 min。样品分为三层：底层为蓝色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60%。

4. 把400-600 μl水相转移到新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10 min。（异丙醇作用为沉淀RNA）。该步骤中的10 min可以缩短为5 min（贴壁细胞可以换成5 min，原代细胞10 min）。

5. 4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清。（离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀）(注意：该步骤很关键，一定要弃干净。弃掉一次之后再甩一下用将管壁的残留离心下来，用白枪头吸尽残存的液体)

6. 加入1mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。4℃ 7600 rpm离心5 min，用枪头吸尽残存的乙醇。（该步骤用100%乙醇洗涤和75%乙醇洗涤差别不大，配置75%乙醇比较浪费DEPC水）

7. 打开离心管管盖，室温放置干燥，使残存的痕量乙醇挥发殆尽，直至白色沉淀看不见为止即可。

8. 加20~50μl DEPC水溶解。

四、注意事项