Cas9x海星生物|细胞电转实验介绍

转染 ，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术，是我们完成项目的最基本方法。转染大致可分为3种途径：物理介导（电穿孔法、显微注射、基因枪）、化学介导、生物介导（病毒介导）。

细胞电转染

一、 实验原理：
细胞电转染（电转），也叫细胞电穿孔，是用短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会让电流可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促，从而使外源大分子物质DNA、RNA、蛋白质、一些小分子等进入细胞膜内部。

二、 影响因素

1.细胞状态

为保证电转后细胞的存活率，最好选取处于对数生长期的细胞。因为处于对数生长期的细胞分裂更为旺盛，细胞膜表面结构的致密性与稳定期的细胞相比较差，因此在电转后，细胞膜的恢复能力更强，从而提高电转后的细胞存活率。同时，处于有丝分裂期的细胞会更容易接受外源物质，有利于提高细胞的转染效率。

2.电转参数

选择合适的电转参数对于电转实验非常重要，电转参数包括电压（500v-1900v）、脉冲（10 ms-45 ms）、次数（1-5），一般都分布在这一区间内。参数过低，不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔，外援物质无法进入细胞内达到转染的目的；参数过高，细胞膜发生不可逆破碎，细胞死亡率增加，转染失败，因此在电转染实验中合适的电转参数尤为重要。不同细胞的形态、特性及耐受度等都不同，实验前需要我们先通过电转预实验来摸索出最合适的电转参数，而后再进行正式试验。

3.其他电击会对细胞造成一定程度的伤害，而具有细胞膜修复成分的电转缓冲液可以将电击对细胞的损伤降到最低，从而降低转染后细胞的死亡率，提高转染效率。

三、 电转预实验
实验目的：在开展正式实验前摸索出最合适的电转参数。

实验流程

1.实验前准备：电转杯、电转枪、电转Tip头（无菌）；处于对数生长期的细胞（细胞状态良好，至少维持合适密度生长2代，未发生过汇合）；

2.设置若干个实验组，贴壁细胞建议1×105个/组、悬浮细胞建议2×105个/组；

以贴壁细胞为例：弃去培养上清，用PBS轻柔冲洗细胞，抽净PBS，加胰酶消化细胞，待细胞脱落后加完全培养基终止消化，轻柔的吹打细胞悬液，尽量形成单细胞悬液，计数，取细胞与1.5 EP管内，离心，PBS清洗一遍。加入带荧光指示的质粒，用R Buffer重悬，尽量避免产生气泡。

3. 准备一块24孔板，往各孔中各加入完全培养基；向电转杯里加入E Buffer。

4. 使用电转Tip头，开始电转，先进行电压的摸索，即固定脉宽及次数。电转后将细胞悬液打入事先准备好的24孔板内吹匀，24h 后观察荧光。

5. 选择荧光最好的一组，来进行脉宽及次数的摸索，24h 后观察荧光。

6. 综合选择荧光最佳的一组参数作为预实验参数。

作者：海星生物

公众号：Cas9X细胞基因敲除

以上内容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供

服务内容：CRISPR/Cas9细胞基因编辑　载体构建/病毒包装 PDO/动物模型CDX　稳转细胞株 干细胞/原代细胞 培养试剂盒