USP9X使DVL2去泛素化，以调节WNT途径的规范

写在前面

        今天推荐的是由范德比尔特大学细胞与发育生物学系在2019年7月23日发表于Cell reports（2020IF：9.423，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Jason A. MacGurn教授，研究表明USP9X使DVL2去泛素化，以调节WNT途径的规范。

研究背景

        WNT信号网络由多个受体组成，这些受体通过不同的转导途径传递各种输入信号，以执行多种复杂和特定环境的输出过程。WNT信号网络的完整性依赖于典型和非典型途径之间的适当规范，鉴于几种信号转导元件在途径之间是共享的，这就对该信号网络的剖析提出了挑战。

摘要部分

        在此，作者报告了USP9X（一种去泛素化酶）和WWP1（一种E3泛素连接酶）调节DVL2（一种WNT信号蛋白）上的泛素化。作者的研究结果表明，USP9X介导的DVL2的去泛素化是典型的WNT激活所必需的，而DVL2泛素化的增加与定位到富含肌动蛋白的突起和平面细胞极性（PCP）途径的激活有关。作者提出，WWP1-USP9X轴调节DVL2上的泛素控制器，其参与规范经典WNT或WNT PCP途径。这些发现对人类癌症中USP9X的治疗目标有重要意义。

研究内容

1.WWP1的WWD域协调与USP9X和DVL2的相互作用     

        为了确定调节WWP1功能的因素，作者使用稳定同位素标记与定量蛋白质组学在 MDA-MB-231 细胞中生成WWP1相互作用谱。为了验证定量蛋白质组学获得的结果，作者通过免疫共沉淀证实了 FLAG-WWP1与几个假定的相互作用物（包括USP9X、DVL2 和 SPG20）的相互作用。作者还进行了WWP1的内源免共疫沉淀，并在内源性表达水平上确定了与USP9X和 DVL2 的相互作用。值得注意的是，USP9X和 DVL2 都包含多个 PY基序，能够结合NEDD4家族E3泛素连接酶的WW结构域。

        作者设想WWP1的WW结构域可能起到将这些蛋白质支架成复合物的作用。为了测试这一点，作者生成了WWP1WW域点突变变体。尽管单个WW域对于与 DVL2 和USP9X的相互作用并非必须，但作者发现具有点突变的WWP1变体破坏了每个WW域（wwp1-4ww）与USP9X的相互作用，同时与DVL2的相互作用完全丧失。

研究结论：WWP1与MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的USP9X和DVL2相互作用。

2.USP9X和DVL2中的PY基序促进了与WWP1的相互作用     

        基于上述实验结果，作者设想SP9X和DVL2中的PY基序是参与WWP1所必需的。为了测试DVL2的两个PY 基序是否是DVL2结合WWP1所必需的，作者构建了DVL2变体，在各个PY 基序上发生了点突变，并使用FLAG-DVL2进行共同免疫沉淀分析。该分析显示， PY2（PPPY568）是与WWP1相互作用所必须的，而PY1（FPAY393）没有作用。此外，这些结果表明，DVL2-WWP1的相互作用并不影响DVL2与USP9X的接合。     

        作者假设，USP9X中的PY 基序也有助于它与WWP1的相互作用。作者构建了一个USP9X变体，删除了该蛋白的C端部分。删除两个C-端PY 基序导致完全失去与WWP1的相互作用。值得注意的是，USP9X与WWP1相互作用的丧失并不影响其与DVL2的相互作用，表明USP9X与DVL2的相互作用是独立于WWP1发生的。

研究结论：DVL2-WWP1的相互作用是由DVL2的PY2结构与WWP1的WW1或WW3结构结合决定的。

3.WWP1和USP9X在DVL2上建立了一个泛素流变体

        WWP1还没有报道过调节DVL2。鉴于WWP1和DVL2之间的物理相互作用，作者认为DVL2可能受到WWP1的E3活性的泛素共轭。作者发现，重组WWP1对血凝素（HA）标记的DVL2表现出泛素连接活性，而且这种活性在DVL2的赖氨酸缺陷变体中消失。重要的是，作者还发现USP9X可以逆转WWP1对DVL2的泛素化作用，表明DVL2是WWP1和USP9X的底物。作者接下来假定WWP1的E3泛素连接酶活性和USP9X的去泛素化酶活性的协调可能有助于在DVL2上建立一个泛素控制器。为了验证这一点，作者将DVL2与WWP1和USP9X孵育，作者发现WWP1和USP9X的不同摩尔比影响了DVL2上泛素化的程度。

研究结论：WWP1和USP9X的协调运作可以在DVL2上建立一个泛素控制器。

4.USP9X促进经典WNT的激活     

        作者随后探究USP9X是否调节WNT信号。通过TopFLASH报告试验和b-catenin稳定化测量，usp9x被敲低或敲除会减弱WNT的激活。在usp9x敲除的细胞中观察到的WNT信号缺陷被野生型FLAG-USP9X的瞬时表达所回补，而不是其无催化活性的变体，表明USP9X的催化活性对典型的WNT激活是必需的。此外，作者发现用WP1130（一种已知可抑制USP9X去泛素化酶活性的小分子）处理细胞，可抑制WNT3a对典型WNT的激活。这一结果表明经典WNT激活需要USP9X。

        为了进一步探讨USP9X活性促进WNT激活的可能性，作者瞬时转染了FLAG-USP9X的表达载体，并测量了WNT3a刺激下的WNT激活情况。重要的是，作者发现野生型FLAG-USP9X的瞬时表达导致典型WNT途径的激活增加。作者推测，在没有USP9X的情况下，典型WNT激活的丧失可能是由于WWP1或其他NEDD4家族E3泛素连接酶的活性未被控制。另一方面，作者发现在usp9x敲除的细胞中，WWP1或NEDD4L的协调敲除抑制了典型WNT激活的丧失，这表明多个NEDD4家族成员的过度激活，包括NEDD4L和WWP1，可能在没有USP9X的情况下减弱WNT信号。另一方面作者发现WWP1拮抗典型WNT激活的能力与它结合DVL2的能力相关。

研究结论：USP9X促进典型WNT的激活，而WWP1则拮抗典型WNT的激活。

5.USP9X对WNT的调节需要DVL2去泛素化     

        为了解决USP9X调节典型WNT的机制，作者首先测试了USP9X是否需要通过LiCl--一种GSK3的抑制剂来稳定b-catenin。重要的是，LiCl介导的稳定不需要USP9X，表明USP9X在b-catenin破坏复合物的上游发挥作用。重要的是，作者发现敲低或敲除USP9X会导致DVL2蛋白的稳态丰度下降，而且SDS-PAGE的移动性变化与超泛素化一致。     

        作者随后对从MDA-MB-231细胞和USP9X敲除的FLAG-DVL2亲和纯化物进行了SILAC-质谱分析（MS）。通过分析来自DVL2的多磷酸化肽和泛素残余（diGly）肽，发现在没有USP9X的情况下，四个内部赖氨酸表现出泛素化的升高。为了测试USP9X介导的WNT信号调节是否需要DVL2泛素化，作者表达了DVL2与UL36 DUB结构域融合，发现在没有USP9X的情况下抑制了WNT的激活缺陷。

        作者接下来探究USP9X可能调节DVL2上的多个泛素化事件的可能性。作者发现表达一个 "无赖氨酸 "的DVL2变体，将所有编码的赖氨酸残基换成精氨酸（DVL2-K0），足以在没有USP9X的情况下恢复WNT的激活。

研究结论：USP9X介导的DVL2的去泛素化对于激活经典的WNT信号传导至关重要。

6.DVL2的泛素化状态调控着与经典WNT和WNT-PCP因子的相互作用

        作者推测，在没有USP9X的情况下，DVL2泛素化状态的改变会调节其作为信号转导蛋白的功能。为了验证这一假设，作者首先用SILAC-MS分析了MDA-MB-231细胞中DVL2的相互作用网络。一些相互作用通过共同免疫沉淀和免疫荧光显微镜下的共定位得到证实。为了量化DVL2的相互作用如何受到泛素化的影响，作者进行了SILAC-MS蛋白质组分析，结果表明，CD型UL36-DVL2融合体（可稳定泛素化）与蛋白酶体亚单位和VANGL1/cofilin的相互作用更大，而催化活性UL36-DVL2融合体（不能稳定泛素化）与AP-2复合物的相互作用更大。

        作者还使用SILAC-MS来量化DVL2的相互作用在usp9x敲除细胞中的变化。在usp9x敲除的细胞中，DVL2与VANGL1和cofilin的相互作用更多（DVL2泛素化升高），但在USP9X存在的情况下，DVL2与AP-2的相互作用更多（DVL2泛素化较少）。这些结果表明，泛素化的DVL2与VANGL1/cofilin--WNT-PCP途径的组成部分有更多的相互作用，而去泛素化的DVL2与AP-2复合物有更多的相互作用，而AP-2复合物对规范的WNT激活至关重要。

研究结论：DVL2泛素化状态与经典WNT或WNT-PCP通路因子有关联。

7.USP9X调控DVL2的细胞分布并拮抗WNT-PCP     

        VANGL1和cofilin在迁移的MDA-MB-231细胞中定位于富含F-actin的突起，DVL2是这些细胞中WNT5a诱导的细胞迁移所必需的。作者认为USP9X的缺失可能导致DVL2重新定位到MDA-MB-231细胞中富含肌动蛋白的突起。为了验证这一点，作者用免疫荧光显微镜来描述在有无USP9X的情况下FLAG-DVL2在MDA-MB-231细胞中的分布。在用对照siRNA处理的MDA-MB-231细胞中，DVL2在整个细胞体中呈点状分布，而MDA-MB-231 siUSP9X敲除细胞显示DVL2重新分布到富含肌动蛋白的突起。在有无USP9X的情况下，对DVL2的细胞分布进行量化，发现失去USP9X后，DVL2在富含肌动蛋白的突起中明显增加。重要的是，WWP1的敲除抑制了DVL2的重新分布，表明在没有USP9X的情况下，DVL2重新分布到富含肌动蛋白的突起需要WWP1的活性。

        WNT5a介导的PCP激活的一个特征是Rho激活，它依赖于DVL2，并且是WNT-PCP途径诱导细胞迁移所必需的。鉴于作者的发现，作者假设DVL2在缺乏USP9X的MDA-MB-231细胞中重新分布到富含肌动蛋白的突起，可能会导致Rho的激活。事实上，作者发现MDA-MB-231细胞通常表现出大约35%的最大Rho激活，而缺乏USP9X的细胞表现出50%的最大Rho激活。表面MDA-MB-231细胞中USP9X的缺失导致DVL2重新分布到富含肌动蛋白的突起和Rho激活。

研究结论：USP9X调控DVL2的定位并拮抗WNT-PCP的激活。

8.USP9X以依赖DVL2泛素化的方式调控细胞运动能力     

        已知VANGL1、cofilin和DVL2协调WNT-PCP的激活，以调节肌动蛋白的动态，促进MDA-MB-231细胞的运动、迁移和转移。因此作者认为USP9X介导的对DVL2的调节可能会拮抗WNT-PCP介导的细胞运动。有趣的是，作者发现缺乏USP9X的MDA-MB-231乳腺癌细胞与野生型的细胞相比，运动能力明显增加。     

        作者假设，DVL2泛素化的提高可能有助于在USP9X基因敲除的MDA-MB-231细胞中观察到的运动性增加的表型。与这一假设一致，作者观察到WWP1的敲除抑制了usp9x敲除细胞运动性表型的增加。为了测试泛素化的作用，作者分析了稳定表达DVL2-UL36（催化活性和CD）DUB融合蛋白的MDA-MB-231细胞的细胞运动性。作者发现敲除USP9X导致对照组细胞和表达CD DVL2-UL36融合蛋白的细胞的运动能力增加，但表达催化活性DVL2-UL36融合蛋白的细胞则没有。这一结果表明，在没有USP9X的情况下观察到的运动能力增加的表型需要DVL2泛素化的增加。

        最后，作者测试了DVL2泛素化是否是WNT5a诱导MDA-MB-231细胞运动的必要条件。有趣的是，作者发现，与表达CD DVL2-UL36的对照组细胞相比，表达具有催化活性的DVL2-UL36能显著抑制WNT5a诱导的细胞运动。基于该发现，作者提出USP9X和WWP1对DVL2的活性平衡调节WNT途径：USP9X介导的DVL2去泛素化促进了典型的WNT信号传导，WWP1介导的DVL2泛素化驱动了WNT-PCP的激活和细胞迁移。

研究结论：USP9X是MDA-MB-231细胞中PCP激活和细胞运动的一个重要拮抗剂，而且这一功能依赖于DVL2的泛素化。

结论与讨论

        作者确定了一种E3-DUB相互作用，其功能是对WNT途径进行分层调节。研究结果表明, WWP1和USP9X的活动是相互拮抗的其功能是在DVL2上建立一个泛素控制器，是WNT途径规范的一个关键调节器。在功能上， USP9X拮抗WWP1对DVL2的活性，尽管作者的数据不能排除WWP1-USP9X相互作用在多泛素化的DVL2上发挥连锁作用的可能性。最终，通过严格的生化分析，剖析了调节DVL2不同泛素化和去泛素化活动的平衡机制，这对于了解其在经典或非经典WNT信号途径中的规范是如何确定的至关重要。

Thank you!

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.06.083