免疫组化实验 (IHC)

原理

通过颜色来显示蛋白质的有无，定位，以及含量变化的病理学常用技术

流程

材料

1，切片

石蜡切片厚度5微米，40摄氏度水温展平组织后防脱玻片捞片，60摄氏度烘箱，烤片30分钟

注意：对骨或者皮肤这些易脱片的组织，可适当延长烤片的时间。

2，脱蜡至水

目的：目的是为了脱去组织石蜡，让组织水化，易于孵育

二甲苯脱蜡三缸，每缸10分钟

注意：具体时间根据室温和二甲苯的新旧程度灵活调整

100%，85%，70%酒精各浸泡10分钟

水洗：避免水流直接冲洗组织

3，灭活

目的：灭活内源性过氧化物酶，减少对显色系统的干扰

材料：内源性过氧化物酶阻断液

室温孵育10分钟

PBS缓冲液水洗3次，每次5分钟

注意：对于内源性过氧化物酶含量高的组织，可适当延长孵育时间或增加过氧化氢浓度

4，抗原修复

目的：让目的蛋白的结合表位暴露出来

材料：EDTA或柠檬酸修复液

EDTA微波热修复5-8分钟，冷却至室温

注意：样本固定时间过久或阳性表达不强，可适当增加修复的次数和强度。

5，封闭

目的：封闭非特异性结合位点

材料：免疫组化笔

用此笔在玻片上画圈防止试剂流出，滴加5%BSA或封闭血清，37摄氏度孵育30分钟

6，一抗孵育

滴加一抗，37摄氏度孵育1-2小时

PBS缓冲液清洗三遍，每次5分钟

注意：初次实验，建议做一抗做浓度梯度，以确定最佳的一抗稀释比例

7，二抗孵育

滴加HPR标记羊抗兔

37摄氏度孵育30分钟

PBS缓冲液清洗三遍，每次5分钟

注意：根据一抗种属决定二抗的类型

8，显色

材料：DAB显色液

配置：1mlB液+1滴A液混匀

滴加DAB显色液，镜下观察，控制显色时间

之后终止反应，水洗，玻片烘干

9，复染

材料：苏木素染色液

苏木素复染40秒，蒸馏水水洗，反蓝液浸泡1分钟，水洗

10，封片

材料：封片剂

依次70%，85%，100%酒精梯度脱水，每缸3分钟

依次二甲苯透明，三缸，每缸2分钟

晾干后中性树胶封片，观察实验结果及拍照