奥维森科技：微生物组学测序送样指南②

上一期奥维森科技：微生物组学测序送样指南①中已经给大家介绍了一些微生物常见样本类型的收集流程及相关送样建议。但在科学研究中，也有很多老师会涉及一些非常规样本，而这些样本往往较难收集或收集方法较复杂。本期小编继续为大家整理了微生物非常规样本类型的收集流程，以供大家查阅参考！

生物类样本微生物取样方法

（一）不同类型样本建议送样量

（二）不同类型样本收集流程

1、舌 苔

取样前禁食、禁烟酒等，用无菌水漱口多次，以除去食物残渣。之后用无菌拭子沿舌根向前滚动刷取舌苔30次，刷取后的无菌拭子浸入含有生理盐水或PBS缓冲液的离心管中，搅拌拭子多次，以确保拭子上的微生物尽可能多的转移到缓冲液中。缓冲液4℃、5000 g离心5 min，弃去上清液，取沉淀于-80℃储存。

注意事项：

可重复擦拭操作几次，合并多次采集的样本，以确保收集的舌苔样本充足。

2、鼻腔分泌物

用无菌拭子轻轻擦拭鼻腔黏膜表面，每个鼻孔采用同一个拭子在相同区域擦拭两次。左、右侧鼻孔样本作为组合样本进行取样和汇集，并做好标记。擦拭后立即将棉签置于含有生理盐水或PBS缓冲液的离心管中，于-80℃储存。

3、呼吸道

（1）上呼吸道

① 鼻腔取样

将洁净的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子擦拭另侧鼻道内鼻腭。擦拭后立即将棉签置于含有生理盐水或PBS缓冲液的离心管中，于-80℃储存。

② 咽喉取样

让患者深呼吸张开口腔，发“啊”音，用压舌板轻轻压舌，将洁净的咽拭子来回擦拭双侧扁桃体及咽后壁。擦拭后立即将棉签置于含有生理盐水或PBS缓冲液的离心管中，于-80℃储存。

注意事项：

a.咽喉取样时，拭子不能接触到口腔和舌粘膜。

b.取样时间最好在发病72 h内，晨起后。

c.鼻腔和咽部样品，可只收集一种，也可同时收集2种并混合。

（2）肺组织

收集切除的病变组织和病理诊断所要求的组织样品，用生理盐水或无菌水清洗，去除淤血或其它脏物，放入冻存管中，液氮速冻后于-80℃储存。

注意事项：

a.由临床医生和病理医师在进行手术过程中切除获取组织样本，切除样本前准备好组织收集容器、组织切割工具和保存分割的组织样本块的冻存管。

b.确保正确采集病变组织和非病变对照组织（如肿瘤附近约1-5 cm），且不会对参与者产生不利影响。

c.记录下手术切除部位和其它组织样本相关的手术信息。

d.肺组织样本应在手术切除后20 min内，进行液氮速冻。

e.取材时避免取到肿瘤坏死部位和不具有代表性部位的组织。

（3）肺泡灌洗液

① 人肺泡灌洗液

对拟要灌洗肺段经活检孔做局部麻醉，利用纤维支气管镜对肺中支气管用37℃灭菌生理盐水多次灌洗，可每次30-50 mL，总量100-250 mL，不超过300 mL。每次注液后用合适的负压吸引获取肺泡灌洗液，一般回收率应达注入液量的40%-60%。灌洗液用双层无菌纱布过滤，除去粘液和较大杂质，装入无菌离心管或其他无菌容器中。灌洗液4℃、20000 rcf高速离心10 min，取沉淀于-80℃储存；或者将灌洗液用0.22 μm孔径滤膜过滤，滤膜装入离心管中于-80℃储存。

② 小鼠肺泡灌洗液

小鼠经麻醉固定后，从颈部切口，暴露剥离气管，剪开气管的1/2，行气管插管，用1 mL注射器抽取1 mL的生理盐水，通过气管插管注入气管内，反复抽吸三次，将液体抽出收集于无菌离心管内。再抽取1 mL生理盐水，重复上面的操作两次。灌洗液4℃、20000 rcf高速离心10 min，取沉淀于-80℃储存；或者将灌洗液用0.22 μm孔径滤膜过滤，滤膜装入离心管中于-80℃储存。

注意事项：

a.推荐使用的负压为-13.3 - -19.95 kpa，要防止负压过大过猛。

b.小鼠采样时一般为颈部和胸部解剖，气管和一侧肺叶结扎，再用穿刺针插入气管上端，针头不要插太深，以免损伤肺。

c.小鼠采样时如果回收遇到很大的阻力即可拔出注射器，收集灌洗液。在灌洗的时候可以轻轻的按摩一下，特别是回抽的时候这样做能够提高回收的效率。

4、母乳

用手轻轻挤压乳头及乳房刺激泌乳反射，当母乳开始流动时，丢掉第一滴后用无菌吸乳器收集母乳，采集约20 mL左右放入无菌容器中，于-80℃储存。

注意事项：

a.采样人员不留长指甲，彻底洗净双手。

b.样品采集前，用肥皂和水清洗乳房，或用酒精擦拭表面。

5、阴道

用灭菌棉拭子（可用无菌生理盐水湿润）在阴道后穹隆、中间点、入口处沿壁多次擦拭（根据实验需求选择取样部位），每个样本2-3个拭子。取样完成后将棉拭子头放入采集管内于-80℃储存。

注意事项：

a.取样前7 d不能使用阴道或外阴药物；取样前48 h内，避免使用加氯消毒的游泳池或浴盆。

b.女性测试者必须在非生理期取样，取样前不要进行性行为，不要使用避孕药、栓剂、女性喷雾剂等。

c.注意要丢弃有出血的样品。

6、血液

推荐使用EDTA抗凝的采血管收集全血样本，采集后将血液收集于无菌冻存管中于，-80℃储存。

注意事项：

a.不要选择肝素或肝素钠作为抗凝剂，取血后，颠倒混匀几次。

b.不要直接使用BCT管冻存，以免破损。

7、尿液

用肥皂水以及酒精对尿道口周围进行清洗，采集中段尿液40 mL左右于无菌容器中。或使用无菌导尿管，从膀胱中采集尿液。建议尿液4℃、20000 rcf高速离心10 min，取沉淀于-80℃储存。

注意事项：

a.女性留取尿样本时应避开经期，并防止阴道分泌物混入尿液。

b.中段尿：在排尿过程中，弃去前、后时段排出的尿液。

8、胆囊

（1）胆结石

在开腹胆囊切除术或腹腔镜胆囊切除术中，从患者胆囊中取出结石，并用无菌的一次性钢刀对结石进行四边形切割。然后用新的外科刀片松开结石内部，采集结石内部放入无菌离心管中，于-80℃储存。

（2）胆汁

在开腹胆囊切除术或腹腔镜胆囊切除术中，用一次性无菌针管或无菌导管吸取胆囊胆汁到无菌离心管中，于-80℃储存。

9、石蜡切片

于无菌环境下，用无菌针头或显微切割方法，切取石蜡切片中间部分组织于无菌离心管中，-80℃储存。一般单个切片为单个样本。

环境类样本微生物取样方法

（一）不同类型样本建议送样量

（二）不同类型样本收集流程

1、土壤结皮

选择样点后，除去生物土壤结皮表面的落叶，用无菌镊子夹取表层结皮，并用小刀尽量刮掉结皮背面粘附的尾矿。采用多点取样法，采集重量相当的结皮样本进行均匀混合，于-80℃储存。

2、海洋、河流沉积物

根据研究目的选择合适地点的沉积物样本进行取样，一般建议取10 g以上，置于无菌离心管中，于-80℃储存。

3、堆肥

在各处理堆体的顶部、中部和底部取三个子样品（每个子样品约50 g，湿重），混合均匀后形成一个混合样品（约150 g，湿重），分装为多管备份后于-80℃储存。

4、厨余垃圾

根据研究设计选择适当的厨余垃圾，挑去大块杂质后经过搅碎装入无菌离心管中，每个样品取样2-10 g，于-80℃储存。

5、岩石、沙砾类

将收集的石子、沙砾、煤块等类型样本置于50 mL无菌离心管内，加入PBS缓冲液后漩涡振荡，使微生物从样本表面充分脱落并聚集在PBS缓冲液当中。缓冲液4℃、20000 rcf高速离心10 min，取沉淀于-80℃储存；或者将缓冲液用0.22 μm孔径滤膜过滤，滤膜装入离心管中于-80℃储存。

样品收集、储存、寄送基本原则

1、严格无菌操作：样品采集所用工具、收集管均需满足无菌条件，取样环境如不能满足无菌条件也应尽量清洁；

2、取样时尽量避免样本受到干扰，尽量缩短保存和运输时间，以保证样品原始状态的微生物群落组成状态；

3、样品收集管密封严实（封口处用封口膜封好）后储存于-80℃；

4、送样优先选择新鲜采集的样本，其次才是冻存样本；

5、用于DNA样品制备实验的样品前处理或切割分装过程尽可能在冰上快速进行，避免因时间过长导致样品降解；

6、样品冻存期间，避免反复冻融；

7、寄送时用大体积干冰运输，且要保证在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余；

8、样品标记清晰且与样品信息单一致，管盖管身均需写上标记，自封袋建议在两个及以上的不同位置都写上标记。

以上就是小编精心梳理的微生物非常规样本类型的收集流程及注意事项啦！合格的样本是准确获取样本微生物组数据和项目顺利完成的基础，因此规范的取样及送样真的很重要。我们接收样本后，如果发现任何异常，也会及时跟老师沟通并反馈样本情况。如果您对于微生物组学送样方面还有疑惑，请与小编联系，欢迎各位老师前来咨询！