Nat Methods重磅技术: 对活体脑组织的致密4D纳米级重建
大脑计算和信息存储与人类约860亿神经元的突触网络结构密切相关。为了探索这种拥挤而复杂的组织的结构、连接和功能活动是如何随着时间的推移而演变的，理想的方法是使用一种能够对活体脑组织进行成像和计算机重建的技术。
将活体脑组织三维重建到单个突触水平，将为解码大脑复杂而密集的信息处理网络的动力学和结构-功能关系创造机会；然而，这受到了光学成像3D分辨率不足、信噪比不足和光负担过高的阻碍。电子显微镜（EM）重建通过追踪所有神经元结构并以单个突触的准确性确定连接，从而解码“连接体”，为大脑结构提供了最详细的见解；然而，这仅限于静态表示，而特定的分子标记需要相关的方法。基于光学显微镜的组织重建技术将能够观察生命系统中的结构动力学。复杂的脑组织需要3D超分辨率方法，因为重建受到最低分辨率方向（通常沿光轴；z方向）的限制。常规（衍射限制）显微镜无法实现，其最佳横向分辨率约为所用光波长的一半，轴向分辨率低至约1000 nm用于组织相容物镜和远红色激发。
本文介绍了在单个突触水平上对活体脑组织的密集重建。该技术在纳米级分辨率的3D重建中解锁形态动力学，同时访问分子和功能信息。该研究开发了一种集成的光学/机器学习技术，打破了实时超分辨率成像中3D分辨率、信噪比、速度和光负荷的相互制约。该技术基于受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）显微镜。该研究组修改了STED，以提高SNR和各向同性超分辨率组织成像，并结合两阶段深度学习策略。
该研究使用野生型C57BL/6J小鼠，试验流程包括：器官海马切片、ECS标记、整体海马的急性制备及标记、大脑类器官产生、LIONESS成像、重复体积实时成像、PSD95 HaloTag标记、病毒载体组装和突触素标记、髓鞘标记、钙显像及化学遗传学激活、电生理学分析；SulfoAtto 643的合成与表征、重构网络训练、去噪、显像图像处理、体积图像扩展、轴突示踪、手动分割和校对、自动分割、可视化、树突提取、手动分段和校对、区分重构不准确和生物移动、PSD95相对于神经元结构的定位、统计和再现性。
第一阶段利用了来自大量单独的先前测量的样本结构信息，在不牺牲分辨率的情况下减少了光负荷和成像时间，从而实现了活组织兼容的体积超分辨率成像。
第二阶段改编自EM连接组学，将体积实时成像数据转化为纳米级解析的实例分割。这项技术称为实时信息优化纳米拷贝、实现饱和分割（live information-optimized nanoscopy enabling saturated segmentation，LIONESS）。LIONESS将实时成像与无偏见的纳米级重建相结合，通过形态学动力学、分子身份和神经元活动信息扩展组织分析。
图1.LIONESS能够实现活体脑组织的密集重建
图2.分割验证
然后将LIONESS应用于DG中的活体海马神经胶质，以无限制地可视化该复杂区域的结构。重建了不同的细胞成分，包括有髓和无髓轴突、棘树突和神经胶质细胞。与EM类似，自动分割的校对仍然是一个时间限制因素，因此通常更倾向于选择性地将其应用于感兴趣的结构。确定了29个轴突，其中一个突起直接接触脊椎头部，产生了39个潜在的突触。大多数轴突形成单或双连接；然而，也观察到三重和四重接触。长度和密度的量化都与以前的数据保持一致。
图3.活体海马的连接重建
分子信息重建
接下来，将活分子标记的关键方法集成到组织重建中。亲和标记证实了特定结构的身份，如有髓轴突。值得注意的是，光学显微镜在观察特定蛋白质方面是无与伦比的。使用与内源性PSD95蛋白融合的HaloTag的敲除表达，可视化所有兴奋性突触后末梢。该研究确定了16个轴突与重建的树突伸展进行分子验证的突触接触，形成了18个连接，同时否决了一个形态学提示但PSD95缺失的连接。兴奋性突触优先位于树突棘，但也可以发生在轴上，尤其是在棘突中间神经元上。该研究使用组合的分子/结构信息来确定具有轴位置的兴奋性突触的比例，与突触分子的共焦读出的比较进一步说明了LIONESS增强的3D定义。
图4 活体脑组织的分子信息重建
形态动力学和活性
首先对相同的海马神经胶质体积进行了3d LIONESS重复成像。测试了图像恢复和分割不准确性在多大程度上限制了形态动力学的检测，作为对照。比较了配对测量中相同树突棘的手动分割，其中生物运动在同时重复测量中被排除，或者在10分钟的测量间隔期间可能发生结构变化。同样，虽然恢复的3D数据和手动分割的不确定性主要存在于体素水平，但轴突形状的更明显变化很容易检测到。
设计了一种全光方法来关联活体细胞网络中的3D结构和信号。重点研究了海马回路。接下来，开发了一种更精细的方法来研究活性和动力学，将化学遗传学靶向细胞活化与Ca2+成像和同一活体标本的动态重建相结合。在DG颗粒细胞中稀疏表达了病毒编码的DREADD（由设计药物独家激活的设计受体）43hM3Dq，在应用生物正交药物氯氮平-N-氧化物（CNO）时增强了神经元兴奋。与转基因GCaMP6f的表达一起，这允许控制DG门中大型苔藓纤维的活性并对其进行成像，然后用LIONESS将其与突触后门苔藓细胞的复杂棘重建在一起。对相邻苔藓纤维丛的可视化进一步阐明了空间关系。然而，由于其对活体组织的适用性，LIONESS有能力直接在活体状态下重复检索活动和动态结构信息，并有可能遵循结构可塑性并确定结构-功能关系。
图5 海马苔藓纤维-肝门苔藓细胞突触的三维形态动力学和化学遗传学诱导的Ca2+活性
电生理学
使用LIONESS，光学显微镜不仅可以用于指导电生理实验，还可以将单个和突触连接神经元的电特性与生存状态下潜在的神经元结构联系起来。只有用LIONESS进行的全面的3D超分辨描绘揭示了在共聚焦模式下遗漏的一个干预的、未标记的神经元过程。这证实了LIONESS适合于在活体标本中多模式检索和关联组织结构的结构和功能方面，并且在这方面比衍射限制成像更强大。
为了扩展分析量并嵌入中尺度背景，遵循了两种直接的策略
首先，记录多个部分重叠的体积可以对它们进行3D配准，从而使分割平滑地扩展到边界。从四个连续的成像体积中重建了急性制备的小泡中70μm长的大部分平行轴突纤维，捕获了约3 mm累积轴突长度。
其次，以共焦分辨率将LIONESS嵌入到更大的体积中。成像650000 DG嵴中的µm3体积提供了位置背景，并允许识别更大的物体，如细胞体细胞和主要树突分支，而LIONESS显示了DG颗粒细胞的轴突和嵌入神经胶质细胞内陷的其他轴突。因此，跨空间尺度的成像产生了关于细胞位置和身份的信息，扩展了LIONESS对形态动力学和连通性分析的解释。
该研究组开发了一种重建活脑组织及其时间进化的技术，结合分子信息和活动的操纵和读出，从而弥合了高准确但静态的EM表示与光显微镜重建阳性标记、不完整的细胞亚群之间的差距。总之，LIONESS开启了对活哺乳动物大脑和其他器官中复杂、动态组织结构的解码，并可能最终挑战我们对中枢神经系统可塑性的程度和意义的思考方式。
该研究开发了集成的光学/机器学习技术LIONESS（实时信息优化纳米拷贝，实现饱和分割）。通过机器学习，利用对全面、细胞外标记组织中的受激发射耗尽显微镜的光学修改和先前关于样本结构的信息，同时实现各向同性超分辨率、高信噪比和与活体组织的兼容性。这允许在突触水平上进行密集的基于深度学习的实例分割和3D重建，结合分子、活动和形态动力学信息。LIONESS为研究活体脑组织的动态功能（纳米）结构开辟了途径。
原文出处
Velicky, P., Miguel, E., Michalska, J.M. et al. Dense 4D nanoscale reconstruction of living brain tissue. Nat Methods (2023). https://doi.org/10.1038/s41592-023-01936-6
编译作者：VONVEY（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）
