「青莲聚焦」蛋白质组学在癌症免疫研究中的应用

癌症的生存和发展取决于肿瘤细胞逃避免疫识别的能力，随着对癌症免疫和肿瘤免疫逃逸机制的深入理解，使得免疫治疗法的发展成为可能。一些无法治愈的癌症转移性患者中，免疫治疗产生了前所未有的应答率，具有持久的完全应答的潜力。然而，原发性和获得性耐药机制限制了免疫治疗的效果，进一步的免疫治疗发展需要更深入地了解免疫细胞和肿瘤细胞之间的相互作用。

2023年1月4日，由哥本哈根大学诺和诺德基金会蛋白质研究中心的科学团队发表在Seminars in Immunopathology ( IF=11.759 )期刊上题为“Proteomics tostudy cancer immunity and improve treatment”的文章，本篇综述讨论了基于质谱（MS）的蛋白质组学在肿瘤免疫和癌症免疫治疗背景下的临床前和临床研究方面的潜在贡献。

基于MS的蛋白质组学于1988年首次被引入，现在是最全面的方法用于定量分析蛋白质、研究蛋白与蛋白之间相互作用、亚细胞定位以及用于蛋白质翻译后修饰（PTMs）等。

基于MS的肿瘤免疫研究的蛋白质组学临床样本类型通常有：肿瘤活检组织、荧光激活细胞分选（FACS）的细胞、患者来源的细胞培养物、外周血单个核细胞（PBMCs）、血浆等。

肿瘤活检组织的深层蛋白质组学分析

Harel等人的一项开创性研究代表了对免疫治疗反应的最早的深度蛋白质组学分析。作者分析了116例福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的蛋白质组，这些活检组织来自接受TIL或抗PD1免疫治疗的IV期黑色素瘤患者。生信分析显示在两种治疗中，应答者的氧化磷酸化和脂质代谢均高于非应答者。FFPE蛋白质组学分析的优点是对样本进行回顾性分析，但这也存在一些缺点，首先FFPE组织切片中PTM没有被完全保存。其次会丢失了所有关于肿瘤微环境(TME)复杂性的信息。

为了克服第一个限制，组织标本可以在收集后立即快速冷冻并进一步冷冻粉碎。这种策略将允许深度磷酸化蛋白质组分析，随后可以与免疫分析整合。为了克服第二个限制，生物信息学反褶积法可用来识别大块肿瘤内的不同细胞群。

FACS分选的细胞和培养的细胞蛋白质组学分析

另一种处理TME复杂性和肿瘤异质性的潜在方法是FACS分选细胞的蛋白质组学分析。目前已经提出了多种样品制备方案，如Amon等人基于基于DIA的无标记蛋白质组学方法，将肽检测量降低到300 ng，相当于25000个已分类的细胞。

另外，来自TME的细胞在蛋白质组学分析之前可以在体外进行培养，这种体外实验可用于降低TME的复杂性，提高蛋白含量以便于进行深度蛋白质组学分析。原代细胞可以被TME中产生的细胞因子或生长因子（如IFN-γ和TNF-α）刺激，为了揭示关键的细胞信号传导参与者，磷酸化蛋白质组学可能是一种有趣的应用方法。另一个潜在的蛋白质组学应用涉及到蛋白质间相互作用的研究。纯化的原代小鼠T细胞已被用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。

免疫肽组学用于T 细胞免疫反应靶标鉴定

肿瘤免疫研究中，基于质谱的蛋白质组学最有前途的应用之一是通过免疫肽组学识别肿瘤抗原，即对肿瘤细胞表面表达的人类白细胞抗原（HLA）结合肽的质谱分析。肿瘤抗原的发现对于开发为患者量身定制的免疫疗法至关重要，如CAR-T细胞疗法和癌症疫苗。T细胞对肿瘤细胞的识别需要HLA分子在抗原呈递细胞（APCs）表面呈递肿瘤抗原。HLA-I类（HLA-I）分子呈递的多肽主要来自于内源性抗原肽，并与CD8 + T细胞相互作用。HLA-II类（HLA-II）分子呈现呈递是由内吞/内噬蛋白降解的多肽，并与CD4 + T细胞相互作用。免疫肽群主要由来自自身“正常”蛋白的多肽和一小部分肿瘤特异性多肽组成。

血浆蛋白质组学分析

血浆由于其可获得性和相对稳定性，是生物标志物发现的一个有吸引力的样本来源。事实上，它是测量大多数与宿主免疫相关的蛋白质的首选样本类型，包括细胞因子、趋化因子、补体蛋白和免疫球蛋白。利用质谱分析血浆样本的主要挑战是蛋白质丰度的极端动态范围。高丰度蛋白（如白蛋白、纤维蛋白原和免疫球蛋白）占蛋白总量的99%，进而掩盖低丰度蛋白的信号。不同的策略已经被用于减少丰度的动态范围，增加血浆中低丰度蛋白的识别(图3)。选择性去除高丰度蛋白如白蛋白和免疫球蛋白，会增加蛋白质的检测数量，但会影响样本的完整性，因为许多可溶性蛋白与白蛋白结合。另一种增加血浆蛋白质组深度的方法是富集细胞外囊泡（EVs），检测位于EV中的细胞内蛋白和膜蛋白，为分析提供了一个新的生物学思路。

还有一种方法是通过非特异性结合与纳米颗粒来选择性富集低丰度蛋白。将不同的纳米颗粒与不同的表面化学成分结合时，可以从血浆样本中定量多达2000种蛋白质。

未来的展望

采用质谱法进行单细胞分析

为了更深入地了解癌症免疫，基于MS的蛋白质组学技术将很快被应用于单细胞水平的TME研究。基因组中的DNA或RNA可以通过聚合酶链式反应进行扩增，相反蛋白和肽信号不能以类似的方式扩增，因此，用于分析单细胞蛋白质组的质谱仪需要具有高灵敏度来检测低细胞丰度的蛋白质。为了克服单细胞蛋白质组学中的一些挑战，采用串联质谱标签（TMT）技术，通过在每一个TMT通道中加入数百个细胞作为载体蛋白组从而增加MS信号。单细胞蛋白质组学的另一种替代策略是最近引入的深度视觉蛋白质组学（DVP），它将先进的显微技术和数字病理学以及基于MS的单细胞蛋白质组学和人工智能结合在一起。DVP在表征肿瘤组织异质性和TME的研究方面特别有前景。它将人工智能驱动的细胞表型图像分析与自动化的单细胞或单核激光显微解剖以及超高灵敏度质谱相结合，能够在保留空间背景信息的同时分析来自单细胞类型的数千种蛋白质。此外，作者还综述了质谱流式细胞技术，流式细胞术是在单细胞水平上评估免疫系统的理想平台，结合质谱技术可以对单细胞进行多参数检测，并在单细胞水平上研究免疫系统，也是流式细胞技术一个新的发展方向。