实时荧光定量PCR（RT-PCR）

自发明以来的 30 多年里，聚合酶链式反应 (PCR) 已成为分子生物学家的主要技术。 其不可或缺的秘诀在于其简单性和多功能性。 该技术的许多变体已经被开发出来； 其中之一，实时PCR，已成为基因表达定量研究、确定临床样本中的病原体载量以及检测 SNP/突变的首选方法。

什么是实时 PCR？

顾名思义，实时 PCR 在每个扩增循环结束时（即实时）测量 PCR 产物的量。 为此，您在每个扩增循环的引物延伸步骤期间或之后标记 PCR 产物。

实时荧光定量PCR检测方法

实时 PCR 中有两种主要的 DNA 定量方法。图1概述了这些。 一种使用 DNA 嵌入药物或小沟靶向染料，在结合时显示增强的荧光。 在每个扩增循环中，随着模板 DNA 量的增加，结合的荧光团数量增加，因此荧光信号的强度增加。 流行的荧光嵌入染料包括 SYBR® Green I 和 SYBR® Gold。 它们的主要优势是成本，但它们是非特异性的并且结合所有 dsDNA 而不仅仅是靶标。

图1.荧光定量PCR检测方法

第二种方法使用荧光团标记的序列特异性 DNA 探针。 多种化学物质用于检测。 最流行的类型使用 Taq 聚合酶的 5'-3' 核酸外切酶活性来分解寡核苷酸，该寡核苷酸分别在 5'- 和 3'- 末端具有荧光团和猝灭剂。 聚合酶的核酸外切酶活性有助于将荧光团与猝灭剂分离，从而增加荧光。 但是，如何根据荧光强度确定核酸的量呢？

从荧光信号到 DNA/RNA 定量

在反应的指数阶段，荧光强度与 PCR 产物的量成正比，实时 PCR 中的定量依赖于这种关系。 在每个扩增循环中，荧光强度成比例增加。 如果您从模板的更多副本开始，您可以在更少的扩增循环中达到阈值荧光强度（比基线信号高 10 倍）。 达到此强度阈值所需的循环次数称为目标 DNA 的 Ct 值。

您可以通过以下两种方式之一使用 Ct 值。 第一，您可以将其与标准曲线进行比较，标准曲线是 Ct 值与目标 DNA 已知浓度对数的半对数图。 然后，您可以从此图进行插值，以确定未知样本中目标 DNA 或 RNA 的绝对拷贝数。 第二，在同一试管中通过多重实验共同扩增管家基因，或在单独的实验中扩增。

简而言之，这就是实时 PCR。