ELISA样品制备

为了保证ELISA实验数据的可靠性，在收集标本前都必须有一个完整的计划。我们提倡新鲜样品应尽早检测，对收集后一周内检测的样本，及时储存在4℃备用。如有特殊原因需要周期性收集样本，在取材后讲标本及时分装后放在-20℃或-80℃条件下保存。因冰箱与室温有一定温差，蛋白容易降解，直接影响实验质量，故应避免反复冻融。不同的样本请根据实际情况处理。

利用到ELISA 技术进行检测的样本类型包括：血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清，皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等。

　　样品制备方法

　　1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

　　2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3、尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4、细胞裂解液：1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集）2）将收集到的细胞用冷 PBS 洗 3 次3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融）：① 超声破碎：取适量 PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞 悬液，使细胞急剧震荡破裂；② 反复冻融：将待破碎的细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复 3 次，使细胞溶胀破碎。4）将标本于 2-8 度 1500×g 离心 10 分钟，收集上清备用。

5、细胞培养上清：检测分泌性的成分时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成分时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6、脑脊液、肺泡灌洗液：样本收集后于1000×g 离心20分钟，离心后收集上清，并将标本保存于-20度，且应避免反复冻融。

7、皮肤组织：用匀浆机加冰的 PBS 研磨 20-50 mg 的皮肤组织使其充分溶解，离心 20 分 钟，10000 g/分钟，取上清检测。

8、粪便：尽量采集干的粪便，粪便过稀会较难处理且降低检测的准确性。采集的重量应大于50mg，将粪便用PBS洗3次（最终粪便质量：PBS 体积=1:9），用超声粉碎（或捣碎）后于5000×g离心10分钟，取上清检测。

9、唾液：将样品收集于离心管后在-70 度冰冻 1 小时。在冰上融化样品后，2000×g 离 心 10 分钟，取上清检测。

10、组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

11、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

12、不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。