文献解读｜单细胞水平结直肠癌肝转移的时空免疫图谱
期刊：Cancer Discover（38.272）
导读
肝转移仍然是结直肠癌患者长期生存的主要障碍，也是癌细胞的高度动态扩散途径。除癌细胞外，肝转移的肿瘤微环境(TME)具有高度的免疫抑制表型，诱导抗原特异性T淋巴细胞的全身性损失，并推动肿瘤的扩散。目前仍不清楚免疫细胞如何在空间上协调结直肠癌肝转移(CRLM)进展及转移细胞微环境是否与原发细胞不同。因此，迫切需要记录、识别和量化CRLM的细胞甚至空间景观，以刷新我们对转移生物学的理解。
科学问题
利用单细胞测序和空间转录组技术探索结直肠癌肝转移（CRLM）的免疫图谱，研究肿瘤微环境在原发位点和转移位点之间的变化情况。同时探究新辅助化疗（NAC）对肿瘤微环境（TME）改变的确切影响。
实验设计
来自20个患者89例样本进行单细胞转录组测序（scRNA-seq），对来自4个患者8例样本进行空间转录组测序（ST）。
技术：scRNA-Seq、ST、mIHC（多色荧光免疫组化）
实验思路
实验结果
1. 整合单细胞和空转数据量化可切除CRLM样本中免疫细胞多样性
文章对20例患者89个样本进行scRNA-seq, 4例患者8个样本进行ST测序，其中13例患者54个样本treatment-naive, 6例患者30个样本行新辅助化疗部分缓解(PR)，5例患者中13例为病情进展(PD)或病情稳定的新辅助化疗患者(SD)。所有肿瘤都是微卫星稳定的。文章整合了所有178,630个CD45+细胞，进行了聚类分析，并使用SingleR和细胞标记基因定义了主要的细胞类型。我们从CRLM样本中鉴定出髓细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞。值得注意的是，T细胞比例在不同的组织类型中明显不同，这表明免疫微环境的组织异质性。结直肠癌和成对肝转移均显示CD45+细胞中约10%的调节性T细胞(Treg)，而在邻近正常组织中这种细胞很少。这表明肿瘤内免疫受到抑制，以前认为这是由于肝转移的免疫治疗效果降低。
同时，两名未治疗患者和两名NAC-PR患者的8个样本(配对结直肠癌和肝转移)的ST数据进行分析。无监督聚类分析将样本划分为不同的区域，如肿瘤区和成纤维细胞区(下图F)。为了整合scRNA-seq和ST数据，文章使用Seurat来量化主要的免疫亚群。在未处理的样本中，我们观察到与scRNAseq一致的免疫细胞模式，如CD8+ T细胞在肝转移和结直肠癌中显著富集(下图G)。相比之下，在NAC处理的样本中，观察到肿瘤区域更小，免疫细胞分布不规则。特别是在肝转移中，只有一小部分斑点聚集成癌细胞，说明NAC治疗后细胞间隔发生了根本性的重塑。综上所述，这些结果突出了NAC处理后的CRLM患者免疫细胞的时空动态格局巨大的重塑。
2.转移性肿瘤富集免疫抑制细胞，尤其是MRC1+CCL18+M2-like巨噬细胞
考虑到患者的细胞组成不同，文章使用scDC来估计细胞比例，过滤了低丰度的免疫细胞，聚类免疫细胞比例(下图A)。在未处理的样本中，免疫细胞丰度可分为六种不同的模式(邻近结直肠癌高、结直肠癌高、邻近肝脏高、LM高、结直肠癌高和肝脏高)。邻近的结直肠癌样本显示AIM2+记忆B细胞、TCLIA+-naive B细胞和CD4+-naive T细胞比例最高，而结直肠癌样本大多富集FOXP3+ Tregs。MAIT细胞、NK细胞和FGFBP2+GZMB+ CD8+ T细胞在邻近的正常肝组织中富集。相反，肝转移中特异性存在一些免疫抑制细胞，其中SPPI+巨噬细胞和MRCI+ CCL18+巨噬细胞急剧增加(图2B)。文章发现MRCI+CCL18+巨噬细胞具有Kupffer细胞特征，这表明它们可能来源于肝Kupffer细胞。中性粒细胞，据报道作为潜在的原体参与者，也在肝转移中富集(下图B)。我们进一步使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)来量化免疫细胞亚群的空间分布。结果发现MRCI+ CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞在未经治疗的肝转移中富集(下图C)。这些数据与scRNA-seq的数据部分一致，进一步证实了肝转移的潜在抑制性TME。
文章使用多重免疫组化(mIHC)对另外27例CRLM患者(n = 18，未经治疗;n = 9, NAC-PR)。在未经处理的样本中，观察到FOXP3+ Tregs、MRC1+ CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞在结直肠癌和肝转移中的浸润显著增加，这与scRNA-seq数据基本一致(图F)。其次，文章利用ssGSEA对CRLM的批量微阵列数据集中的免疫细胞进行评分。文章检查了原发肿瘤和转移性肿瘤之间的细胞丰度。在该验证队列中，MRCI+ CCL18+巨噬细胞、SPP1+巨噬细胞和中性粒细胞在转移性肿瘤中均显著升高。TCGA数据队列中原发肿瘤中MRC1+CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞的高评分均预示预后明显较差。推测特定的巨噬细胞亚群可能在CRLM中原生细胞生态位的形成中起着重要作用。
3. 转移性肿瘤中巨噬细胞转向抑制状态
鉴于肝脏转移中巨噬细胞亚群的富集，文章假设这些肝脏转移富集的巨噬细胞在不同的组织中可能具有不同的功能。因此，我们进行基于配体受体的癌症免疫串扰分析，比较原发和转移部位。结果显示SPP1+巨噬细胞和MRC1+ CCL18+巨噬细胞在肝转移和结直肠癌的所有不同的交叉通话细胞类型中排名较高。这一结果表明，肝转移性癌细胞可能会优先重编程巨噬细胞并诱导其特定的功能状态(下图A)。值得注意的是，肝转移中的转移性肿瘤细胞优先表达配体CD47。文章进一步利用mIHC对这些蛋白进行共表达可视化。这些配体受体对特异性富集于肝转移，为靶向治疗肝转移提供了线索。
为了精确定位特异的TME印迹的差异，文章在结直肠癌和肝转移巨噬细胞之间进行了差异基因表达分析。APOE和其他M2极化相关基因如MARCO也在肝转移富集的MRC1+CCL18+巨噬细胞中显著上调(下图E)。相比之下，富集于结直肠癌的MRC1+CCL18+巨噬细胞具有更高水平的炎性细胞因子表达，包括TNF、ILIB、CCL3和CCL4。通路富集分析显示(下图F)，在结直肠癌和肝转移的MRC1+ CCL18巨噬细胞中，代谢通路都显著富集，突出了代谢在决定这些巨噬细胞功能中的基本作用。值得注意的是，文章发现结直肠癌中MRC1+ CCL18t巨噬细胞富集氧化磷酸化，而肝转移中MRC1+ CCL18t巨噬细胞以氨基酸代谢为主。这些数据强调，代谢调节可能介导巨噬细胞的表型和功能转移，以响应不同的微环境改变。
4. 在肝转移中MRC1+CCL18+巨噬细胞代谢活性急剧增加
为了了解髓系细胞在CRLM中的代谢图景，文章通过scMetabolism计算抑制性巨噬细胞和单核细胞在每一条代谢通路中的活性得分。结果显示肝转移浸润的MRC1+ CCL18+巨噬细胞在所有髓系细胞中表现出最高的代谢活性，表明它们非常有活力，这可能与它们在转移部位的独特功能有关。进一步对MRC1+ CCL18+巨噬细胞的所有代谢相关基因进行无监督聚类，观察到与周围组织相关的强烈代谢偏好，在结直肠癌和肝转移浸润的MRC1+ CCL18+巨噬细胞中鉴定出42种可能上调的代谢途径。差异表达的代谢基因并发现原发性和转移性浸润的MRC1+ CCL18+巨噬细胞中代谢基因特异性上调。ILAI1和MIF是巨噬细胞激活所必需的基因也表现出类似的特征。文章使用mIHC验证了这些代谢酶，观察到基本一致的结果。结果表明代谢在决定MRC1+ CCL18+巨噬细胞表型中起着重要作用。
5. NAC响应与非响应性肿瘤包含独特的免疫动态
为了探索NAC对抗肿瘤免疫的影响，文章使用TooManyCells对所有CD45+细胞进行了聚类分析。结果表明结直肠癌和肝转移的细胞聚类有明显的差异（下图A）。NAC对TME的影响具有高度的细胞类型特异性和环境依赖性（下图B\C）。通常，在PR肿瘤中，NAC可以下调免疫抑制细胞并激活细胞毒性细胞。在肝转移中，反应性NAC下调了SPP1+巨噬细胞，上调了GZMK+ CD8+ T细胞和XCL1+ CD8+ T细胞等细胞毒性T细胞，特别是在NAC- pr肿瘤中保留了几个MRC1t+CCL18+巨噬细胞和几十个SPP1+巨噬细胞，提示NAC在抑制巨噬细胞谱系中的潜在作用。然而，在PD/SD肿瘤中，存在与PR肿瘤不同的免疫细胞变化。例如，肝转移中SPP1t巨噬细胞和MRC1+ CCL18+巨噬细胞水平升高，而细胞毒性免疫细胞(即FGFBP2+GZMB+CD8+ T细胞)水平下调(下图C、E和F)。这些相反的结果可能是由器官特异性和治疗疗效相关的癌细胞重塑所解释的。总之，这些结果表明，有效的NAC不仅能重编程肿瘤内免疫平衡，还能激活全身抗肿瘤免疫反应，为支持NAC在可切除的CRLM中的潜在应用提供了证据。
结论
本文使用scRNA-seq和ST.定义了CRLM的细胞和空间免疫景观。数据显示，在肝转移中，免疫微环境经历了广泛的时空重塑，免疫抑制细胞显著富集，这与之前基于大量样本的研究一致。特别是，MRC1+ CCL18+巨噬细胞表现为终末分化状态，表现为代谢活跃的表型，对新辅助化疗敏感。该研究不仅揭示了以前未被认识到的CRLM免疫生态系统的多样性，而且为癌症研究界提供了更为全面的资源。
参考文献：
Wu Y, Yang S, Ma J, Chen Z, Song G, Rao D, Cheng Y, Huang S, Liu Y, Jiang S, Liu J, Huang X, Wang X, Qiu S, Xu J, Xi R, Bai F, Zhou J, Fan J, Zhang X, Gao Q. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level. Cancer Discov. 2022 Jan;12(1):134-153. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-0316. Epub 2021 Aug 20. PMID: 34417225.
