单细胞转录组测序教你如何挖掘lncRNA数据！
编者按
欧易生物单细胞转录组测序项目文章不断来袭！近日，欧易生物合作客户山东第一医科大学附属眼科研究所周庆军、史伟云团队在Molecular Therapy: Nucleic Acids（IF：8.886）发表人类角膜内皮细胞单细胞测序的相关结果，王群博士和窦圣乾博士为文章共同第一作者，欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序相关服务。值得一提的是，这篇文章基于单细胞转录组的数据挖掘了相关lncRNA的信息，下面我们一起学习这篇文章的具体内容。
基本信息
材料：4份健康人类角膜内皮样本的16924个细胞
期刊：Molecular Therapy: Nucleic Acids
发表时间：2022年2月
方法：欧易生物10× Genomics单细胞转录组测序
研究背景和研究目的
角膜是一种透明的无血管组织，保护眼睛免受感染，并有助于将光线聚焦在视网膜上。角膜内皮通过屏障和泵作用调节水合作用，对维持角膜清晰度至关重要。随着年龄的增长，角膜内皮细胞（CEnCs）的逐渐丢失与Fuchs角膜内皮营养不良（FECD）的发展有关，但FECD发展的机制仍然存在许多未知。尽管直接或间接的研究表明，在培养的人类角膜内皮细胞中存在异质性，但角膜内皮细胞在单细胞水平上的细胞状态和功能的差异仍不得而知。因此，这篇文章旨在单细胞水平上分析角膜内皮细胞的异质性，并揭示不同细胞亚型在功能、代谢过程和细胞与疾病的关系中的作用。
内容概述
这项研究中，作者对来自4个人类角膜内皮样本的16924个细胞进行了scRNA-seq，并绘制单细胞图谱，发现了角膜内皮细胞的4个亚群具有独特的特征。随后作者研究了FECD致病与各细胞亚型之间的关系，并确定了一个具有FECD相关基因优先表达模式的潜在致病细胞群。结合FECD样本的bulk RNA-seq数据，揭示了lncRNA NEAT1为C0内皮亚群中表达量最高的基因, 但在FECD中明显下调。通过建立UVA诱导的FECD动物模型，证实Neat1敲降可加重FECD进展；相反，CRISPR激活的腺病毒传递过表达系统能够保护角膜免受UVA诱导的FECD。这项研究提供了人类角膜内皮细胞图谱，表明lncRNA NEAT1在FECD中的重要作用，为研究角膜内皮疾病的发病机制和潜在的治疗模式提供了重要的来源和基础。
具体研究内容解析
1. 单细胞转录组测序揭示人角膜内皮细胞的细胞异质性
为了探索人类内皮细胞的异质性，作者从健康供体的角膜内皮分离细胞并使用10x Genomics平台进行单细胞测序（Figure 1A），经过预处理和质控后，共获得16942个高质量细胞，平均每个细胞有5050个基因和28159个转录本。tSNE降维聚类后共分为4个cluster（Figure 1B和C）。差异基因富集分析发现C0富集与氧水平反应和氧化还原过程相关的功能，C1与翻译伸长和肽代谢有关，C2与DNA复制和细胞周期有关，C3参与免疫应答和对未折叠蛋白的应答（Figure 1D）。
前期体外实验的研究已表明CD166/CD44CEnCs效应细胞可用于治疗角膜内皮功能障碍，因此，作者在单细胞水平展示这两个基因表达分布，发现C0与效应细胞的表面表型基本吻合（Figure 1F）。Top marker的分析表明各cluster基因表达的异质性，如C0高表达MGP、SLC12A2、SLC2A1和NQO1，C2高表达DNA复制相关基因，如MCM7、 PCNA和MCM3，C3高表达细胞因子相关基因，包括IL11、CXCL3和CXCL8（Figure 1G和H）。同时，组织学染色也证明了C2和C3在人类角膜内皮组织中的存在（Figure 2）。这些结果表明了人类角膜内皮细胞的异质性。
Figure 1. scRNA-seq构建人角膜内皮图谱
2. 4种角膜内皮细胞亚型的独特转录特征分析
通过上述结果可以发现4群角膜内皮细胞存在不同的表达模式，并且C2高表达DNA复制相关基因如PCNA、MCM3和MCM7，因此作者首先进行了细胞周期分析，发现C2细胞处于S期的细胞比例非常高，说明C2细胞可能具有较高的增殖能力或活性（Figure 2A和B）。考虑到角膜内皮是富含线粒体的单层细胞，作者评估了各群细胞线粒体基因的含量，发现C3细胞中线粒体基因的比例明显较低（Figure 2C），同时也发现C3中有更高的衰老相关分泌表型（SASP）评分（Figure 2D），这些结果暗示C3可能是一群衰老样细胞，具有退化功能。免疫荧光成像定位也证实这些细胞中PCNA和IL-11的表达（Figure 2E和F）。
Figure 2. C2和C3群中代表性基因的组织学分析
随后，对C0和C1的差异基因功能富集分析表明2个细胞群之间的独特特征，如C0富集低氧反应和细胞外基质组织等通路，C1则富集细胞死亡调节和应激反应等通路（Figure 3A）。此外，作者通过C1的top marker ITGA6的免疫荧光成像检测了C1细胞的定位（Figure 3B）。角膜内皮细胞通过屏障和泵功能在保持角膜清晰度方面发挥着重要作用，因此作者针对与离子转运和紧密连接相关的基因集进行评分，发现C0的离子转运得分最高，而C1细胞紧密连接的得分最高（Figure 3C）。代谢通路的分析发现C0的糖酵解和氧化磷酸化得分最高，C3细胞的ROS评分更高（Figure 3D），其中糖酵解代谢途径是维持内皮结构和泵送液体所需ATP的主要来源，表明C0细胞在角膜内皮功能中起核心作用。
Figure 3. 4种内皮细胞亚型的转录特征
3. ScRNA-seq和bulk RNA-seq揭示lncRNA NEAT1在FECD中的重要功能
作为最常见的角膜内皮营养不良和角膜移植的主要指征，以往的许多研究将遗传变异与FECD联系起来。因此，作者选取了21个FECD相关基因在单细胞转录组数据中分析其在不同角膜内皮细胞亚型的表达模式，结果表明最高比例的FECD相关基因在C0中富集，如TCF4、TGFB1和COL8A2（Figure 4A），基因集评分也显示与其他细胞相比，C0得分最高（Figure 4B）。这些结果表明C0细胞可能更容易受到遗传干扰，并影响FECD易感性。
因此，作者针对C0细胞的top基因进行分析，发现唯一的一个lncRNA NEAT1，其在各亚型中表达量最高且在top基因中丰度较高。随后，作者对来自正常（n = 3）和FECD（n = 10）个体的角膜内皮的公开bulk RNA-seq数据进行了lncRNA分析，筛选差异基因，结果发现NEAT1在所有差异lncRNAs中表达丰度最高，并且在FECD样本中表达显著降低（Figure 4C-E）。这些结果表明NEAT1可能在FECD中起到关键作用。
Figure 4. lncRNA NEAT1在FECD中表达下调
4. 沉默NEAT1会通过破坏角膜内皮中的氧化-抗氧化平衡而加重FECD
为了进一步研究NEAT1在角膜内皮中的调控作用，作者首先建立了一个非遗传的FECD小鼠模型，该模型的角膜暴露于UVA会再现FECD的症状，随后通过直接注射NEAT1 shRNAs来构建NEAT1敲降小鼠模型，并建立定期的实验装置（Figure 5A）。对照组和敲降组小鼠在没有UVA暴露的情况下，细胞密度没有任何显著差异，但在照射4周的时间点，与阴性对照相比，敲降组表现出细胞密度急剧下降，并表现出更严重的形态学变化，包括细胞大小增加和细胞边界丢失，这表明NEAT1缺乏的角膜内皮比正常的角膜内皮更容易受到UVA照射，并促进了角膜内皮的损伤（Figure 5B和C）。
前期的研究表明氧化应激反应的失衡与FECD发病有关，因此作者使用沉默NEAT1基因的人角膜内皮细胞系探究了NEAT1是否参与了角膜内皮的氧化-抗氧化稳态。结果发现在正常条件下，NEAT1敲降对角膜内皮细胞活力影响不大，而HO处理能显著降低NEAT1-KD的细胞活力（Figure 5F），mtDNA拷贝数检测结果发现NEAT1敲降导致mtDNA拷贝数显著下降，提示mtDNA相关基因下调，线粒体功能受损（Figure 5G），此外，在氧化条件下，NEAT1的敲降也增加了细胞活性氧（ROS）水平（Figure 5H）。这些数据表明NEAT1的缺失可能通过破坏角膜内皮细胞中的氧化-抗氧化平衡加重了FECD进展。
Figure 5. 敲降NEAT1会通过破坏角膜内皮中的氧化-抗氧化平衡而加重FECD
5. NEAT1在体内过表达减轻了了FECD的进展
为了确定NEAT1在保护角膜内皮细胞免受氧化损伤中的作用，作者在小鼠角膜内皮细胞中过表达了NEAT1，并评估了UVA照射对FECD进展的抵消作用（Figure 6A）。角膜在紫外线照射后，相比于NEAT1敲降组，过表达组保留正常细胞大小的形态、明显的细胞边界，与NC组相比，变异系数降低（Figure 6B和C），细胞密度或六边形百分比未检测到显著差异。CCT测量显示过表达组角膜厚度变薄减少，这表明角膜内皮细胞的功能的保留（Figure 6D）。
Figure 6. NEAT1过表达减弱了小鼠角膜内皮细胞在FECD发病过程中的氧化损伤
研究结论
通过单细胞转录组测序首次构建了人类角膜内皮细胞单细胞图谱，揭示了角膜内皮细胞的异质性；
2. C0群细胞与“效应细胞”高度相似，可能为角膜内皮疾病的前房移植细胞的识别提供参考；
3. C2群细胞具有增殖和DNA损伤和修复潜力，针对该群体是否具有干细胞的特征以及它们在增殖或DNA修复中的作用可以进一步研究；
4. NEAT1在健康角膜内皮细胞中FECD相关亚型中高度表达，但在FECD样本中表达显著降低，其可能通过维持角膜内皮中的氧化-抗氧化平衡减轻FECD的进展。
参考文献
Qun Wang, Shengqian Dou, Bin Zhang, Hui Jiang, Xia Qi, Haoyun Duan, Xin Wang, Chunxiao Dong, Bi Ning Zhang, Lixin Xie, Yihai Cao, Qingjun Zhou, Weiyun Shi, Heterogeneity of human corneal endothelium implicates lncRNA NEAT1 in Fuchs endothelial corneal dystrophy, Molecular Therapy: Nucleic Acids Vol. 27 2022.
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