2023.7.11华中农业大学全英文选修课程生物技术中的微生物学课程第四节课程要点
注：内容可能存在不准确情况，配套本人已投稿视频进行观看
Gateway质粒和DNA子克隆：Gateway质粒是一个步骤，可以将基因克隆到质粒中，然后将质粒移动到目标质粒中。使用Gateway质粒的原因是，Gateway质粒比目标质粒更小，更容易进行克隆和亚克隆过程。这使得整个克隆过程更加容易。
酵母模型：酵母是一个模型生物，它是一种易于操作的真核生物，并且有丰富的工具可用于研究它。这些工具包括基因组测序、缺失基因库、GFP库和过表达库。
缺失基因库：缺失基因库是一组菌株，其中每个菌株都缺失了一个不同的基因。这些库可用于研究基因的功能，例如，如果您想知道删除某个基因会产生什么影响，您可以在缺失基因库中找到该基因的缺失菌株，并对其进行研究。
GFP库：GFP库是一组菌株，其中每个菌株都包含一个带有荧光蛋白标记的基因。这些库可用于研究基因的定位，例如，如果您想知道特定基因在酵母细胞中的位置，您可以使用GFP库找到该基因的荧光标记菌株，并观察其位置。
过表达库：过表达库是一组菌株，其中每个菌株都过度表达了一个不同的基因。这些库可用于研究基因的功能，例如，如果您想知道过度表达某个基因会产生什么影响，您可以在过表达库中找到该基因的菌株，并对其进行研究。
酵母模型的优点：酵母模型是研究生物学问题的有力工具，因为它具有易于操作的特点、丰富的工具和已有的资源库，这些使得研究更加快速和高效。
讲述了关于酵母的一些基本知识和使用酵母进行研究的优势，以下是学习要点的中文总结：
酵母是一种单细胞真核生物，可以是二倍体或单倍体，具有繁殖、分裂和性繁殖等特性。酵母的品种有很多，如面包酵母、啤酒酵母等，不同的酵母在研究中具有不同的应用。酵母是一个优秀的研究模型，因为它是单细胞生物，同时也具有性繁殖的特性，可以用于研究生物过程和性繁殖等问题。与大肠杆菌相比，酵母的繁殖速度较慢，但仍然很快，可以在短时间内完成实验。在酵母实验中，与大肠杆菌不同，酵母不能使用抗生素筛选质粒，而是通过营养选择的方法，即通过删除一个必需基因，再将该基因加回质粒中来筛选目标质粒。酵母的应用很广泛，例如研究基因功能、药物筛选、代谢途径等。
涉及到酵母菌质粒的筛选和特征。其中oxytrophic选择是一种常用的筛选方法，它利用酵母菌的oxytrophic标记，如ura3、his3、leu2和trp1等，来选择携带特定质粒的酵母菌。这些oxytrophic标记可以使酵母菌在特定营养条件下生长，而不能在缺少对应营养物质的情况下生长，从而实现质粒筛选。另外，酵母菌的质粒通常包含许多特征，如起始点、选择标记和多克隆位点等。起始点是DNA复制的起始点，它决定了质粒的复制能力。酵母菌的起始点分为高拷贝数、低拷贝数和整合型三种类型。其中，高拷贝数的起始点称为two micron，低拷贝数的起始点称为sen，而整合型起始点则是将质粒与染色体整合在一起。选择标记是帮助筛选具有特定质粒的酵母菌的标记，如ura3、his3、leu2和trp1等。多克隆位点是一些特定的限制酶切位点，它们可用于插入外源DNA片段。此外，还介绍了酵母菌的起源和不同类型的起始点。野生型酵母菌是指从自然环境中收集的酵母菌，而基因工程酵母菌则是通过基因工程方法构建的酵母菌。酵母菌的起始点分为高拷贝数、低拷贝数和整合型三种类型。其中，高拷贝数的起始点称为two micron，低拷贝数的起始点称为sen，而整合型起始点则是将质粒与染色体整合在一起。最后，还介绍了酵母菌质粒筛选中的营养条件和常用的营养物质，如uracil和leucine等。此外，还涉及到酵母菌菌株的分类和鉴定，如野生型和基因工程酵母菌的区别等。
生物技术中使用的酵母菌是经过基因工程改造的GMO酵母菌，而不是野生型酵母菌。在实验室中，研究者需要了解酵母菌的基因型，因为不同的基因型会表现出不同的特性。在研究酵母菌时，常需要测试不同的启动子，以确定哪个启动子能够更好地表达目标蛋白。此外，酵母菌质粒也需要经过人工构建和设计，不同的质粒会对表达产生不同的影响。因此，研究酵母菌时需要了解酵母菌的基因型和质粒设计。此外，酵母菌质粒有一套命名系统，可以通过阅读文献进行解码。
生物技术中基因插入和构建设计的机制。首先是介绍了转座子（transposons），它是一种“跳跃基因”，可以移动到染色体的其他位置。转座子的作用机制是通过转座酶蛋白（transposase）将自己的基因从基因组中剪下来并插入到其他位置。这种机制可以用于将某个基因插入到目标生物的染色体上。然后讲解了如何利用转座子来实现基因插入，即构建一个含有转座酶基因的质粒，并将目标基因与转座子的反向重复序列结合在一起，从而使转座酶将目标基因插入到染色体上。最后还介绍了在实际应用中常用的双质粒系统，即使用一个含有强启动子的质粒和一个含有目标基因及反向重复序列的质粒来实现基因插入。讲述了基因插入的方法。主要包括三种方法：转座子和质粒和同源重组。转座子是一种重要的基因工程工具，可以将基因插入到染色体中，但插入是随机的，位置效应可能会影响表达。而质粒是另一种插入方法，它们是小型环状DNA分子，可以在宿主细胞中自主复制和传递。质粒可以通过选择性抗生素来筛选带有目标基因的细胞。此外，还介绍了质粒的特点，包括它们缺少起始点，因此在细胞内无法自复制，被称为“自杀质粒”。转座子和质粒都是基因插入的有效方法，但应根据具体应用场景选择合适的方法。其中，转座子和质粒法的缺点是需要维持筛选，否则质粒会丢失。同源重组可以具有特异性插入，但同样需要筛选。基因插入的方式有化学转化、电转化和接合。化学转化需要用化学物质处理细胞，然后进行热冲击。电转化需要用电冲击来帮助质粒进入细胞。接合是通过细菌之间的交配管来传递质粒。
述了如何设计一个能将基因插入到微生物中的质粒，并着重介绍了构建设计中需要考虑的要点。以下是学习要点的概括：选择合适的启动子：启动子分为恒定型和诱导型，要根据实验需求选择合适的启动子，同时还要考虑启动子强度的大小。标签的使用：在基因的N端、C端或中间加上标签，来实现目标蛋白的定位和分离纯化。标签分为亲和标签、定位标签和可溶性标签三种类型。亲和标签：可以通过与金属或结合物质结合来进行纯化。定位标签：可以指定蛋白的位置，如核定位信号可以使蛋白进入细胞核。可溶性标签：可以使不溶性的蛋白变得可溶。选择合适的标签：根据实验需求选择合适的标签。标签的作用：可以用于定位、分离纯化、增加稳定性等。
荧光标记
荧光标记是用于标记蛋白质或其他生物大分子的一种常见技术。强调了谨慎使用标记并了解其对蛋白质功能的潜在影响的重要性。荧光标记可能会影响蛋白质的稳定性、折叠、局域构象等方面，因此在使用荧光标记之前需要进行一定的评估和测试，以确保标记不会对蛋白质的功能产生过多的影响。
质粒不相容性
质粒不相容性是指当两个质粒具有相同起源时，它们之间的竞争。这种竞争可能会导致其中一个质粒被排斥或失去稳定性，从而影响克隆实验的结果。在进行质粒构建和克隆实验时，需要注意选择具有不同起源或来源的质粒，以避免质粒不相容性的问题。
限制性酶克隆
限制性酶克隆是一种常用的DNA克隆技术，可以将DNA分子从一个载体（如质粒）中切下并插入到另一个载体中。解释了限制性酶克隆的步骤和需要注意的问题。其中，选择两种限制性酶是非常重要的，以避免DNA分子的重新环化和插入方向的错误。
查找基因序列和选择质粒
在进行克隆实验之前，需要获取目标基因的序列信息，并选择适合的质粒进行克隆。查找基因序列可以通过多种手段实现，例如PCR扩增、基因库筛选、基因合成等。选择质粒时需要考虑多个因素，包括质粒大小、启动子、选择标记、选择抗生素等。
讲述了分子生物学实验中的一些步骤和注意事项，主要包括：选择限制性内切酶时需要考虑价格，有些酶较为便宜，而有些则比较昂贵。需要检查要使用的限制性内切酶的切割位点是否在所需基因内，以免将基因切割成两段。要设计合适的PCR引物，注意在引物的特定位置使用C或G，形成较强的键合。引物的长度也需要考虑，此处介绍了C-G clamp的概念，即在引物的3'端使用C或G来保持引物的稳定性。在设计引物时还需要考虑其退火温度，最好在55-60度之间，同时检查引物是否存在自身互补或发生“发夹”现象，以及引物之间是否会结合。
主要是关于PCR实验过程的讲解。其中包括以下几个步骤：确定前向引物和反向引物的序列、添加限制性内切酶位点、格式化引物的序列以便于定制、选取高保真度聚合酶用于克隆、设置PCR程序、选择PCR程序的温度和时间、添加必要的措施以避免突变。在设置PCR程序时，首先进行初始变性，然后进入循环，其中第一步是变性，第二步是退火。在退火时应该选择两个引物的退火温度之间较低的那个。最后是延伸步骤，其时间取决于目标DNA的长度。在所有步骤中，应该注意避免自身互补和发生发夹现象。选用高保真度聚合酶可以避免突变，保证所得的产物准确。
讲述了PCR实验的几个步骤以及注意事项。要点如下：
热启动（hot start）可以解决PCR实验中出现的发夹（hairpin）问题，可以在85℃时添加聚合酶酶（polymerase）。
在PCR实验中进行纯化（purification）可以获得纯净的DNA样品，可以使用纯化试剂盒进行操作。
在PCR实验中进行限制性内切酶切割（digest）可以将需要的DNA片段从整个DNA样品中分离出来。
在PCR实验中进行琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）可以分离出不同大小的DNA片段。
在PCR实验中进行连接反应（ligation）可以将需要的DNA片段进行连接，并使之永久性密封。
最后一步是将连接好的DNA片段转化到大肠杆菌（E. coli）中进行扩增。
关于克隆基因的实验过程。首先需要将血浆放入大肠杆菌并培养，然后在含有抗生素的培养基上筛选出含有目标基因的菌落。接下来需要进行菌落PCR筛选、测序和限制酶切分析，最终得到目标基因的克隆。在实验过程中需要注意多个细节，如在进行PCR反应前需要进行热启动，需要选取正确的质粒和抗生素，以及进行正确的限制酶切分析等。此外，还需要仔细记录实验过程和结果，以便分析和进一步优化实验。完整的实验步骤和配方可以下载手册进行查看，这是一个比较漫长的实验过程，但是只要注意细节并仔细跟进，就可以成功克隆目标基因。
