【普鲸甲基化小讲堂】第9讲 - 焦磷酸测序初探

上一讲啰哩吧嗦地给大家讲了一下甲基化检测技术的发展脉络，从今天开始我们详细地把前面一讲提到的各种技术方法一一展现给大家。这一讲，我们先来认识一下焦磷酸测序（pyrosequencing）技术。

自从Sanger测序法诞生起，大规模地检测DNA序列信息就变得可行了，但这里还存在几个问题，比如对于多聚核苷酸序列（一堆TTTTTTT或者GGGGGG……这种）的准确识别就是一个问题，此外还有甲基化。我们知道甲基化的核苷酸本身其序列信息并未改变，这样普通的Sanger测序就也没办法识别它了。

好在有了焦磷酸测序技术，它是由Nyren等人在1987年发明出来的一种新型的酶联级联测序技术，它能够很好地弥补普通Sanger测序的不足，进行多聚核苷酸及甲基化的检测，也能检测SNP突变等。

焦磷酸测序，顾名思义，就是指每次随着新的dNTP加入，反应都会产生一个焦磷酸（PPi）分子。它的具体原理是：

🔶  引物与模板DNA退火；

🔶  在四种酶（DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，并生成焦磷酸；

🔶  通过检测每次反应所释放荧光信号的强度，即可实时测定DNA序列的构成。

这样，最后我们根据加入的核苷酸序列及得到的峰图，即可从顺序及峰的面积来读取待测的序列信息了。

在检测甲基化时，我们要先做亚硫酸盐转化，将甲基化的胞嘧啶C保留，而未甲基化的C则最终变成了T，这样就可以在测序时将其分辨出来了。

下面我们来看一下想做焦磷酸测序，具体的步骤应该是什么。

🔶  假设有个朋友叫小A，找到普鲸君想做焦磷酸测序，普鲸君首先要看小A的待测位点有多少，比如是整个约2.5kb的promoter区还是几个CG位点？若是全长promoter区则不划算了，不如缩小到500bp范围测一下。

🔶  确定了待测范围，就要开始做焦磷酸测序的引物评估了，这时就要问小A待检测的样本是什么类型？比如是全血还是FFPE？或者是新鲜组织抑或细胞？因为不同的样本类型其引物设计方法也不同的。

🔶  引物设计评估好了，就可以去合成了，然后小A的样本也要保证一定的质量，譬如浓度最好能够达到30ng/μl的水平。虽然再低一些也可以检测，但成功率就会偏低一些，因此在条件允许的前提下样本浓度还是高一些的好。此外还有纯度（OD≈1.8）和体积（>30μl）的要求。

🔶  做好这一切，就可以上机测序了。

现在焦磷酸测序的生意几乎是Qiagen一家独大了，它们推出了PyroMark Q24、Q48、Q96等一系列产品。我们可以根据需要来选用合适的机型，比如现在比较常规的是PyroMark Q96，而Q48则相对新型一些，它的测序长度更长，input量更低，还能测更多DNA结构等。

好了，今天就介绍到这里了，如果大家有做焦磷酸测序的需要，记得联系普鲸君哦！