样品制备丨艾美捷蛋白质羰基比色测定试剂盒方案
蛋白质羰基化是一种产生蛋白质羰基加合物的翻译后修饰，在氧化应激过程中发生。1羰基由自由基和非自由基活性氧（ROS）在多种氨基酸，特别是赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或苏氨酸残基上生成。这些修饰在化学和代谢上是稳定的，使其成为检测氧化损伤的有用靶点。
艾美捷蛋白质羰基比色测定试剂盒利用DNPH反应以方便的96孔格式测量血浆、血清、细胞裂解物或组织匀浆中的蛋白质羰基含量。在360-385nm之间的吸光度下用分光光度法定量所产生的蛋白质水带的量。然后可以将羰基含量标准化为蛋白质浓度。
非自由基ROS、毒物（如香烟烟雾），或与脂质过氧化过程中产生的醛发生二次反应。蛋白质羰基化在血浆、尿液、支气管肺泡灌洗液（BALF）或多种疾病状态下的组织中升高，包括急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、阿尔茨海默病、慢性肾衰竭、败血症和糖尿病。
已经采取了几种方法来检测和定量蛋白质制剂中的羰基含量。最方便的方法是2，4-二硝基苯肼（DNPH）与蛋白质羰基之间的反应。
艾美捷蛋白质羰基比色测定试剂盒计算：
1.计算每个样品和对照的平均吸光度。
2.从样品的平均吸光度中减去对照的平均吸度。这是校正吸光度（CA）。
3.通过插入校正的吸光度转换为下式：
蛋白质羰基（nmol/ml）=[（CA）/（*0.011µM-1）]（500µl/200µl）
*DNPH在370nm处的实际消光系数为22000 M-1cm-1
（0.022µM-1cm-1）。此值已根据解决方案的路径长度进行了调整颗粒中蛋白质含量的测定（可选）蛋白质在洗涤步骤中丢失；因此，蛋白质水平取决于洗涤后的最终颗粒。
1.将100μl样品对照（C#）从其中一个孔转移到1 ml石英试管中，并加入900μl盐酸胍。这是1:10的稀释。如果需要进一步稀释，用盐酸胍稀释。
2.在浓度范围为0.25-2.0 mg/dl的氯化胍中制备BSA标准品（不包括）。
3.使用分光光度计测定每个稀释样品对照（C#）和每个BSA标准品在280nm处的吸光度。
4.绘制BSA标准品的吸光度与浓度的关系图，以获得标准曲线。使用其吸光度和BSA标准曲线方程计算每个样品对照的浓度——蛋白质浓度（mg/ml）=[（A280-y截距）/斜率]x*2.5 x 10（稀释系数）
*2.5是将结果调整回原始样品体积的校正因子。
羰基含量（nmol/mg）=（羰基nmol/ml）/（蛋白质mg/ml）
或者，可以使用Cayman’s Protein Determination（BCA）（项目号701780）、Protein Determination Kit（项目编号704002）或类似的测定来测量总蛋白质浓度。
艾美捷蛋白质羰基比色测定试剂盒样品制备：
当样品的蛋白质浓度在1-10mg/ml范围内时，该测定效果最佳。建议使用Cayman的蛋白质测定（BCA）试剂盒（项目号701780）、蛋白质测定试剂盒（产品号704002）或类似的蛋白质测定测定法来测量总蛋白质浓度。
血浆
通常，人血浆的蛋白质羰基含量为0.5-4.0 nmol/mg。5
1.使用抗凝剂如肝素、EDTA或柠檬酸盐采集血液。
2.在4°C下以700-1000 x g离心血液10分钟。用移液管移走顶部的黄色等离子体层，不要干扰白色血沉棕黄层。将血浆保存在冰上，直到测定或在-80°C下冷冻。血浆样品将稳定至少一个月。
血清
通常，人血清的蛋白质羰基含量为0.1-1.0 nmol/mg。6
1.不使用抗凝血剂采集血液。让血液在室温下凝结30分钟。
2.在4°C下以2000 x g离心血液15分钟。用移液管移走顶部黄色血清层，不要干扰白色血沉棕黄层。将血清保存在冰上。如果当天不进行分析，则在-80°C下冷冻。样品将稳定至少一个月。
相关文献：
1.Dalle-Donne, I., Giustarini, D., Colombo, R., et al. Protein carbonylation in human diseases. Trends Mol. Med. 9(4), 169-176 (2003).
2.Stadtman, E.R. and Oliver, C.N. Metal-catalyzed oxidation of proteins. Physiological consequences. J. Biol. Chem. 266(40), 2005-2008 (1991).
3.Reznick, A.Z., Cross, C.E., Hu, M.-L., et al. Modification of plasma proteins by cigarette smoke as measured by protein carbonyl formation. Biochem. J. 286, 607-611 (1992).
4.Dalle-Donne, I., Rossi, R., Giustarini, D., et al. Protein carbonyl groups as
biomarkers of oxidative stress. Clin. Chim. Acta 329(1-2), 23-38 (2003).
5.Lenz, A-G., Jorens, P.G., Meyer, B., et al. Oxidatively modified proteins in bronchoalveolar lavage fluid of patients with ARDS and patients at-risk for ARDS. Eur. Respir. J. 13(1), 169-174 (1999).
6.Levine, R.L., Williams, J.A., Stadtman, E.R., et al. Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 233, 346-357 (1994).
7.Reznick, A.Z. and Packer, L. Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric
method for carbonyl assay. Methods Enzymol. 233, 357-363 (1994).
