干细胞是未分化的生物细胞，是可以专门分化的细胞，并且可以分裂（通过有丝分裂）以产生更多的干细胞。它们存在于多细胞生物中。在哺乳动物中，干细胞有两种类型：从胚泡的内部细胞团中分离出来的胚胎干细胞和在各种组织中发现的原代细胞。在成年生物中，干细胞和原代细胞可以用作人体的修复系统，以补充成年组织。在发育中的胚胎中，干细胞可以分化为所有专门的细胞-外胚层，内胚层和中胚层-但可以维持再生器官（例如血液，皮肤或肠道组织）的正常周转。

精密医学：源自患者的干细胞中色素性视网膜炎的基因修复

来自患者成纤维细胞的诱导性多能干细胞（iPSC）可用作自体细胞的来源，用于视网膜疾病的移植。但是，患者来源的iPSC仍然携带病原突变。为了生成健康的患者源细胞，一种基于短回文重复序列（CRISPR）/Cas9的细菌系统（簇状分布）的基因编辑技术可用于修复突变，从而产生不需要患者免疫抑制的新型植物。研究人员测试了CRISPR / Cas9是否可以用于患者特异性iPSC中以精确修复导致X连锁性色素性视网膜炎（XLRP）的RPGR点突变。从XLRP患者的针头活检培养的成纤维细胞被转导产生具有患者c.3070G> T突变的iPSC。使用CRISPR指导RNA，Cas9核酸内切酶和供体同源性转导的iPSC。尽管该基因具有重复序列和富含GC的序列，但RPGR基因拷贝中有13％显示出基因突变纠正和转化为野生型等位基因。这是首次使用CRISPR纠正患有感光细胞变性患者的iPSC中的致病突变。这一重要的概念验证发现支持针对视网膜疾病的个性化基于iPSC的移植治疗的发展。

CRISPR /Cas9β-globin基因靶向人类造血干细胞

β-血红蛋白病，如镰状细胞病和β-地中海贫血，是由β-球蛋白（HBB）基因突变引起的，并影响全球数百万人。研究人员提出了一种CRISPR / Cas9基因编辑系统，该系统将Cas9核糖核蛋白和腺相关病毒载体同源供体结合在一起，以移植人造血干细胞，该造血干细胞可以在患者来源的造血干细胞中进行体外基因校正，然后进行自体移植。在造血干细胞的HBB基因上实现了同源重组。值得注意的是，研究人员设计了一个富集模型，以超过90％的靶向整合率纯化造血干细胞和祖细胞。研究人员还表明，通过使用患者来源的干细胞和祖细胞，它们可以分化为红细胞并表达成年β-球蛋白（HbA）信使RNA，从而有效地纠正了导致镰状细胞病的Glu6Val突变。这证实了细胞编辑的HBB等位基因的完全转录调控。总之，这些临床前研究概述了一种基于CRISPR的方法，该方法通过HBB位点的同源重组靶向造血干细胞，从而促进了β-血红蛋白病的下一代疗法的发展。

CRISPR–Cas9诱导的双链断裂的修复导致大量缺失和复杂的重排

CRISPR–Cas9有望成为临床环境中首选的基因编辑工具。到目前为止，Cas9诱导的遗传变化的探索仅限于靶位点的近端和远距离脱靶序列，并且得出结论CRISPR-Cas9具有合理的特异性。研究人员报道了主要的目标诱变，例如小鼠胚胎干细胞，小鼠造血祖细胞和人类分化的细胞系，这些细胞系具有大量的靶位点缺失和更复杂的基因组重排。研究人员使用了长读测序和长距离PCR基因分型方法，发现单个向导RNA/Cas9引入的DNA断裂通常被解析为多碱基缺失。另外，在切口部位的远端处发现了病变和交叉事件。 CRISPR–Cas9编辑引起的有丝分裂活跃细胞中观察到的基因组损伤可能是致病的。

由Ubigene开发的CRISPR-U™（基于CRISPR / Cas9技术）在双链断裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效，而且CRISPR-U™可以大大提高同源重组的效率并轻松实现敲除（KO），体外和体内的点突变（PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U™ Ubigene已成功编辑了100多个细胞系的基因。

Reference

Bassuk, A., Zheng, A., Li, Y. et al. Precision Medicine: Genetic Repair of Retinitis Pigmentosa in Patient-Derived Stem Cells. Sci Rep 6, 19969 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19969

Dever, D., Bak, R., Reinisch, A. et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature 539, 384–389 (2016). https://doi.org/10.1038/nature20134

Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol 36, 765–771 (2018). https://doi.org/10.1038/nbt.4192

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

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