美国塔夫斯大学David L. Kaplan团队：增强骨再生及神经支配和血管化的3D打印蚕丝-支架

研究背景

全世界每年的植骨手术超过200万例，但都存在供体组织可获得性和供体部位发病率问题的限制或成本和疾病传播的问题。这些问题推动研究者们使用新的、具有成本效益的组织工程方法来研究治疗骨缺陷。3D打印是一种新兴且有前途的技术，可以为所有这些限制提供解决方案。目前用于骨组织工程的临床相关生物材料包括骨块、骨片和骨黏合剂。3D打印允许通过逐层沉积骨黏合剂来模拟三维骨骼结构。丝素蛋白由于其可调节的机械强度和柔韧性，生物相容性和骨整合而被广泛用于组织工程应用。羟基磷灰石是骨骼的主要无机部分，通过将磷酸钙羟基磷灰石与丝相结合，可以更好地利用其化学组成和机械性能以更接近天然骨组织的性能。此外，已有强有力的证据表明血管化和神经在骨修复中的重要性，因此，在骨支架内建立神经血管化网络可以促进更快、更高质量骨组织的再生。

工作介绍

本文开发了一种丝素/羟基磷灰石骨黏合剂，用于三维打印可定制的骨工程支架。为了验证该骨黏合剂作为骨组织工程生物材料的潜力，对其力学性能、结构和微孔率进行了表征。通过研究支架在体外维持人骨髓间充质干细胞黏附、生长、增殖和分化的能力，进一步研究了它们的生物学相关性。最后，使用生长因子和促进骨诱导(BMP2)、血管化(VEGF)和神经支配(NGF)的形态因子对骨黏合剂进行功能化。

图文导读

图1  silk-HAP 材料的表征。(a) 3D 打印的 10 × 10 × 10 mm 立方体的显微计算机断层扫描，显示了立方体的总体外观（右上）、规则的丝状分布和相互连通的孔。比例尺：1 mm。(b) 3D 打印解剖结构：股骨（左）；椎骨（右，上）；下颌骨（右，下）。比例尺：1 cm。(c) 3D 打印结构的扫描电子显微 (SEM)，表明能控制细丝沉积和较大的孔隙（左）；细丝表面存在微孔（中）；用于silk-HAP骨黏合剂的羟基磷灰石 (HAP) 粉末，表明颗粒分布（右）。(d) 3D 打印圆柱体，表明能控制微孔率和细丝沉积。比例尺：1 mm。(e) 未烧结（左）和烧结（右）10 × 10 × 10 mm 立方体，使用 10% silk浓度 3D 打印，显示了烧结对结构外观和尺寸的影响。比例尺：5 mm。(f) HAP粉末、印刷后的silk/HAP 和干燥后的silk/HAP 的FTIR 光谱。(g) 浓度、PBS浸渍和印刷后工艺（如烧结）的影响（1100 ℃，3 小时）。(n = 5)对丝/羟基磷灰石骨黏合剂干燥后的抗压强度(MPa)和杨氏模量。

图2  3D 打印silk/HAP 支架的细胞相容性。(a) alamarBlue (n = 9) hMSCs在 3D 打印结构/聚苯乙烯上培养，分别在生长或成骨培养基中培养35 天。（b-c）在生长培养基中培养 35 天后，3D 打印支架上的hMSCs SEM照片（b）共聚焦显微镜（c，顶部）和明场显微镜（c，底部），显示细胞覆盖率和对支架的粘附，以及细胞在孔中和细丝之间的生长。蓝色：细胞核（DAPI）；白色：肌动蛋白细胞骨架(鬼笔环肽-488)。比例尺：100 μm。（为了解释这个图例中对颜色的引用，读者可以参考本文的网络版本。）

图3  3D 打印支架的骨传导性。人骨髓间充质干细胞在生长培养基或成骨培养基中培养21天后，碱性磷酸酶(ALP)活性与蛋白质含量(上)归一化。在生长（左）或成骨（右）培养基（底部，比例尺：5 mm）中培养 21 天后，对hMSCs进行碱性磷酸酶染色。。（ b ）成骨细胞分化标志物骨桥蛋白(OPN，洋红色)免疫荧光染色，显示OPN在成骨培养基中表达增加。作为参考，细胞核(蓝色，DAPI)和肌动蛋白细胞骨架(白色，Phalloidin-488)显示在顶部面板中。比例尺：100μm。

图4  释放加载到 Silk-HAP 支架中的因子。打印和浸泡的样品中BMP-2（a），VEGF（c）和NGF（e）随时间的释放计算为单因素（BMP-2/VEGF/NGF）和三因素（BVN）。打印和浸泡样品中BMP-2（b），VEGF（d）和NGF（f）随时间的累积释放计算为单因子（BMP-2/VEGF/NGF）和三因子（BVN）。数据 表示为平均值±SD（n=5）。

图5  在没有额外生长因子（对照）的情况下在丝支架上接种7天的hMSC的Runx2（a），OPN（b）和BSP（c）标志物的基因表达，或加载了形态发生因子BMP2在印刷过程之前/后（BMP2打印）。数据为平均值±SE（n=3-5）*:p˂0.05；**：p˂0.01；***：p˂0.001(d） 在培养3小时后覆盖transwell底部（DAPI染色），显示HUVEC迁移情况(e）培养3天和7天后3D打印构支架上HUVEC的alamarBlue强度（n=6）(f）培养7天后3D打印支架上hiNSCs的alamarBlue强度（n=6）。

图6  在丝支架上没有额外的生长因子（对照）或在 3D 打印过程（浸泡）后加载 NGF接种 3 天，巢蛋白 (a)、微管蛋白 β3 (Tubb3) (b) 和微管相关蛋白 2 (MAP2) (c) 的 NSC（巢蛋白）和分化神经元（Tubb3 和 MAP2）标记物的基因表达，数据代表平均值 ± SE (n = 3–5) **: p ˂0.01; ***：p ˂0.001。

图7  培养7天的人骨髓间充质干细胞Runx2(A)、OP(B)、BSP(C)标志物在无生长因子(对照组)、BMP2(BMP)、BMP2和VEGF(BMP2+VEGF)、BMP2和NGF(BMP2+NGF)、BMP2、VEGF和NGF(BMP2+VEGF+NGF)负载下的基因表达。数据代表均值±SE(n=3-5)*：P˂0.05；**：P˂0.01；*：P˂0.001。

结  论

本研究使用丝素-羟基磷灰石骨黏合剂和骨诱导、促血管生成和神经营养生长因子或形态因子加速骨形成，生成功能化的3D打印支架用于骨再生。通过人骨髓间充质干细胞的成骨分化，人脐静脉内皮细胞的迁移和增殖，以及人诱导的神经干细胞的增殖，评估了3D打印支架的功能。该支架具有与骨相适应的力学性能，具有细胞相容性、骨传导性，并保持了细胞因子和形态因子的活性。基于成骨细胞分化相关基因(Run相关转录因子-2、骨桥蛋白、骨唾液蛋白)的上调，确定了BMP-2、VEGF和NGF在体外成骨分化方面的协同结果。将需要进一步的研究来评估体内这些支架设计，预计这些结果将对牙科，口腔和颌面外科的骨再生产生强烈影响。

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