FISH原则与protocol（用于荧光显微镜检测）

FISH原则

荧光原位杂交（FISH）是一种使用荧光探针的技术，该探针与染色体的特殊位点结合，与探针具有高度的序列互补性。 荧光探针是用荧光基团标记的核酸，可以与特定的 DNA/RNA 序列结合。 因此，我们可以通过检测荧光基团来了解特定DNA序列在细胞中的位置和时间。 它是在 20 世纪 80 年代初开发的。 荧光显微镜可用于找出荧光探针与染色体结合的位置，流式细胞术可用于定量检测结合。 此 FISH 协议适用于流式细胞术检测和荧光显微镜检测中使用的 Cy5 和 FAM 标记探针。

图1.荧光原位杂交（FISH）示意图。

FISH protocol （用于荧光显微镜检测）

1. 在 FISH 之前，通过用 500 µl 10% 中性缓冲福尔马林覆盖样品接触区域，标本在 25°C 下固定 30 分钟。

2. 固定后，福尔马林被丢弃，标本在 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中清洗一次。

3. 然后在杂交前将样品在乙醇中脱水（50%、80% 和 95% (v/v) 系列，在每个浓度下暴露于 300 µl 乙醇 3 分钟）。

4. 标本在 55°C 下使用防潮密封的载玻片孵育室杂交 15 分钟。 简而言之，将 500 µl 体积的杂交缓冲液（0.7 M NaCl、0.1 M Tris [pH 8.0]、0.1% 十二烷基硫酸钠、10 mM EDTA，含有探针，预热至 55 ºC）应用于标本和腔室的表面盖子是密封的，在室内创造一个潮湿、温度可控的环境。

5. 15 分钟后，取下盖子，用预热至 55ºC 的无探针杂交缓冲液短暂冲洗样品。

6. 标本上杂交细胞在黑暗中用含有 1.5 µg ml-1 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 的约 30 µl 封固剂进行复染 10 分钟。

7. 然后用盖玻片固定标本并使用荧光显微镜检查。