环状RNA-SEC31A对胰腺癌细胞侵袭、迁移的影响及其机制研究Effects of circular RNA-SEC31A on the invasion and migration of pancreatic cancer cells and molecular mechanism

阴艺娜 苏民 林梓航 陈亚鹏 陈汝福 李志花

中山大学孙逸仙纪念医院肿瘤内科；广东省人民医院普外科

通信作者：李志花，Email：lzhdoct@163.com

 

摘要

目的：明确环状RNA-SEC31A（circSEC31A）在胰腺癌中的表达水平，探讨其对胰腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响及潜在的分子机制。

方法：采用实时荧光定量PCR检测人正常胰腺细胞株HPDE及胰腺癌细胞株BXPC-3、PANC1、CaPan-2、SW1990 circSEC31A的表达水平，选用表达量较高的胰腺癌细胞株进行后续实验。针对circSEC31A设计两条siRNA(#1、#2)，采用脂质体将siRNA转染胰腺癌细胞沉默circSEC31A表达(siR-circSEC31A组)，以不针对circSEC31A设计的siRNA转染胰腺癌细胞为对照组(siR-NC组)，Transwell实验及划痕实验检测circSEC31A对胰腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响。采用circSEC31A探针及oligo阴性对照探针进行RNA Pull-down实验，筛选与circSEC31A结合的miRNA，并验证该miRNA对胰腺癌细胞侵袭、迁移的影响。荧光定量PCR检测沉默miR-200c-3p及circSEC31A对胰腺癌细胞PDK1 mRNA表达的影响。蛋白质印迹法检测circSEC31A沉默对PDK1蛋白及下游相关蛋白Akt、磷酸化Akt(p-Akt)表达量的影响。

结果：胰腺正常细胞株HPDE circSEC31A表达量（1.000±0.120）显著低于胰腺癌细胞株BXPC-3（1.920±0.130）、SW1990（2.93±0.528）、PANC1（4.557±0.692）和CaPan-2（5.247±0.194）的circSEC31A表达量，差异有统计学意义（P＜0.001）。Transwell实验结果显示，与PANC1 siR-NC组穿膜细胞数(1301.3±94.6)个/100倍视野和CaPan-2 siR-NC组穿膜细胞数(1835.0±70.1)个/100倍视野比较，PANC1 siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组和CaPan-2 siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组穿膜细胞数显著下降，分别为(727.3±92.9)、(792.0±18.1)、(718.0±90.6)、(692.7±84.8)个/100倍镜视野；划痕实验结果显示，与PANC1 siR-NC组(55.000±4.359)%和CaPan-2 siR-NC组(69.000±3.606)%比较，PANC1 siR-circSEC31A#1组（20.667±3.215)%、siR-circSEC31A#2组(20.000±4.583)%和CaPan-2 siR-circSEC31A#1组(28.000±8.185)%、siR-circSEC31A#2组(29.667±5.686)%的划痕区细胞覆盖率显著降低；RNA Pull-down实验表明，与PANC1 oligo探针组(1.000±0.091)和CaPan-2 oligo探针组(1.000±0.153)比较，PANC1 circSEC31A探针组(2.237±0.175)和CaPan-2 circSEC31A 探针组(2.166±0.156)miR-200c-3p富集量显著升高；与siR-NC组穿膜细胞数（939.3±57.0）、（786.7±51.5）个/100倍镜视野比较，PANC1、CaPan-2细胞siR-miR-200c-3p组穿膜细胞数增加到（1206.0±99.1）、（1838.0±105.7）个/100倍视野，而siR-miR-200c-3p+siR-circSEC31A组穿膜细胞数又下降到（932.7±116.4）、（785.3±58.8）个/100倍镜视野；与siR-NC组(1.000±0.103、1.000±0.107）比较，PANC1、CaPan-2细胞siR-miR-200c-3p组PDK1 mRNA表达量（1.898±0.159、2.102±0.337）显著升高，而siR-miR-200c-3p+siR-circSEC31A组PDK1 mRNA表达量又显著下降到（0.980±0.070、1.015±0.079）；蛋白质印迹法结果显示，PANC1 siR-NC组、 siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组PDK1蛋白表达量分别为0.767±0.086、0.281±0.191、0.333±0.062，CaPan-2 各组PDK1蛋白表达量分别为0.712±0.038、0.353±0.061、0.308±0.018；PANC1各组p-Akt蛋白表达量分别为0.741±0.050、0.114±0.027、0.139±0.041，CaPan-2 各组p-Akt蛋白表达量分别为0.823±0.052、0.141±0.045、0.280±0.089。siR-circSEC31A组PDK1、p-Akt蛋白表达量均显著低于siR-NC组。以上各组间比较差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。

结论：circSEC31A在胰腺癌细胞中高表达，通过介导miR-200c-3p/PDK1/Akt轴来促进胰腺癌的侵袭转移。circSEC31A可能成为胰腺癌患者早期诊疗潜在的新靶点。

 

全文刊载于《中华胰腺病杂志》

2023年 第23卷 第2期 99-107页

  

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成熟的线状mRNA是由最初转录产物除去内含子并将外显子连接起来形成的一个连续的具有5′端帽子结构和3′端poly A尾结构的RNA分子。而环状RNA（circular RNAs,circRNAs）则是由前体mRNA经特殊的可变剪切，并通过3′剪接供体与5′剪接受体反向共价连接形成的具有环状结构的RNA分子。circRNAs作为一类不具有5′端帽子结构和3′端poly A尾结构的非编码RNA，高度稳定存在于生物体内参与多种重要的生物学过程。近年来研究证实，circRNAs在多种肿瘤中异常表达，通过竞争性结合微小RNAs(microRNAs,miRNAs），使miRNAs与下游靶点mRNA“隔离”，进而间接调控下游基因的表达，在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。SEC31A是外壳蛋白复合物Ⅱ（coat protein complexⅡ,COPⅡ）囊泡运输系统的核心成分，已被认为与非小细胞肺癌的发病机制有关。circSEC31A是由SEC31A基因上的第17～21外显子经过反向剪切并首尾相接形成的闭合环状结构的RNA分子。研究表明，circSEC31A通过调节miR-520a-5p/Got-2轴促进非小细胞肺癌细胞的侵袭、转移,导致患者的不良预后。然而，有关circSEC31A在胰腺癌进展中的作用机制尚未见报道。本研究检测胰腺癌细胞株circSEC31A表达，观察circSEC31A对胰腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响，并探讨其具体的分子机制，以期为胰腺癌患者提供潜在的临床治疗靶点。

 

资料与方法

一、细胞培养

人胰腺癌细胞株BXPC-3、SW1990、PANC1、CaPan-2和人正常胰腺细胞株HPDE均购自美国菌种保藏中心（ATCC）。复苏后，PANC1、CaPan-2和SW1990细胞株采用10%FBS的DMEM培养基常规培养，BXPC-3和HPDE细胞株采用10%FBS的RPMI 1640培养基常规培养。当细胞生长密度达到70%～80%时，用0.25%胰酶消化并收集细胞进行传代或进行下一步实验。

二、胰腺癌细胞株circSEC31A、SEC31A mRNA表达检测及circSEC31A鉴定

采用Trizol试剂提取癌细胞总RNA，用分光光度计测量RNA纯度及浓度。取500ng总RNA，按照反转录试剂盒操作将其逆转录为cDNA，按照qRTPCR试剂盒行PCR扩增，检测各细胞株circSEC31A及SEC31A的mRNA表达量。circSEC31A正向引物序列为5′-AATTTGTTGGCAGCTCAGGG-3′，反向引物序列为5′-TCTCAAAATTGCCCGTCAGC-3′；SEC31A mRNA正向引物序列为5′-CTTGGCTGCGAAGATGAGTC-3′，反向引物序列为5′-GAGCTGCTGTTTCTCGTACG-3′；以GAPDH为内参。反应条件：95℃ 30s，95℃ 5s、60℃ 20s，40个循环。由PCR仪自带软件获取Ct值，通过公式2－ΔΔCt计算mRNA的相对表达量。

采用RNase R降解实验和放线菌素D实验对circSEC31A进行鉴定。

三、沉默circSEC31A胰腺癌细胞株的构建及鉴定

针对circSEC31A反向剪切环状位点设计两条siRNA：siR-circSEC31A#1和siR-circSEC31A#2。siR-circSEC31A#1序列为AACCAGCACAUUAAA-GAGGAATT，siR-circSEC31A#2序列为UGACAACACCAACCAGCACAUTT。

采用脂质体将siRNA转染胰腺癌细胞(siR-circSEC31A组)，以不针对circSEC31A成环位点设计的siRNA转染胰腺癌细胞作为对照组（siR-NC组），转染48h后胰酶消化收获细胞，采用qRT-PCR法验证siRNA的敲低效率。

四、细胞侵袭实验

细胞侵袭实验采用Transwell小室。将融化的基质胶按1∶4比例用无血清培养基稀释后加入Transwell上室，待其凝固。取消化的胰腺癌细胞，重悬于DMEM无血清培养基，取100μl细胞悬液（含1×10 5个细胞）加入Transwell上室，下室加700μl含20%FBS的DMEM培养液。培养24h后弃上室液体，用甲醛固定隔膜上附于外表面的细胞，用棉棒轻轻擦去嵌在隔膜上附于内表面的细胞，用0.1%结晶紫染色15min，取出Transwell小室，置显微镜下随机选择4个100倍镜视野进行拍照并计算穿膜细胞数。

五、细胞迁移实验

将转染48h后的细胞消化离心，培养基重悬，取10 6个细胞铺种12孔板常规培养，设2个复孔。当细胞铺满板底后，使用移液枪10μl枪头垂直在细胞培养板的孔内划痕，再用PBS轻轻清洗划脱的细胞，置显微镜下观察划痕间距并拍照。将12孔板继续常规培养24h，再置显微镜下拍照，计算划痕区的细胞覆盖率。

六、与circSEC31A结合的miRNA筛选

circRNAs通过结合miRNA来减少或消除miRNA介导的靶基因的抑制作用。通过网站circBank获得与circSEC31A结合的10个候选miRNA，包括miR-1184、miR-17-3p、miR-7109-3P、miR-1251-3P、miR-1273g-3P、miR-181a-2-3P、miR-200b-3P、miR-200c-3P、miR-208a-5P、miR-208b-5p，采用circSEC31A探针及oligo阴性对照探针进行RNA Pull-down实验，筛选与circSEC31A结合的miRNA。收集胰腺癌细胞，用裂解液处理后置－80℃备用。磁珠用BSA和酵母tRNA包被，弃去上清后分别加入circSEC31A探针及oligo阴性对照探针孵育2h以包被磁珠。取出冷冻的细胞裂解液，解冻后离心。取500μl细胞裂解液上清与包被探针的磁珠置4℃孵育过夜，收集捕获的RNA复合物。采用qRT-PCR检测与circSEC31A结合的miRNA。其中circSEC31A探针是与circSEC31A接口位置互补结合的生物素标记的RNA，可捕获细胞内源性circSEC31A以及与circSEC31A结合的分子复合物，序列为UUUUCCUCUUUAAUGUGCUGGUUGGUGUUGUCAGG。oligo阴性对照探针无义序列为UUGUACUACACAAAAGUACUG。

七、胰腺癌细胞株PDK1、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达检测

利用RNAInter、mirPath和ENCORI数据库预测miR-200c-3p可能存在结合位点的下游靶基因。采用qRT-PCR检测与miR-200c-3p结合的mRNA。PDK1 mRNA正向引物序列为5′-AGTTCATGTCACGCTGGGTA-3′，反向引物序列为5′-CAGCTTCAGGTCTCCTTGGA-3′。

采用蛋白质印迹法检测胰腺癌细胞株PDK1、Akt、p-Akt蛋白表达量。胰腺癌细胞经胰酶消化并收集，加RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，于冰上剧烈震荡裂解30min，离心取细胞总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。取20μg蛋白，常规行蛋白质印迹法进行检测目的蛋白的表达，以GAPDH为内参。PDK1、Akt、p-Akt一抗工作浓度分别为1∶2000、1∶1 000、1∶1000；二抗工作浓度为1∶2000。最后使用Syngen G曝光机成像，以目的蛋白与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

八、统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行数据分析，GraphPad Prism 9软件作图。正态分布的计量数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

 

结    果

一、胰腺癌细胞株circSEC31A表达及鉴定

正常胰腺细胞株HPDE和胰腺癌细胞株BXPC-3、SW1990、PANC1、CaPan-2的circSEC31A表达量分别为1.000±0.120、1.920±0.130、2.93±0.528、4.557±0.692、5.247±0.194，4株胰腺癌细胞circSEC31A的表达量较HPDE细胞株均明显上调，差异有统计学意义（F=56.915，P＜0.001）。选用表达量较高的PANC1和CaPan-2细胞株进行后续实验。

RNase R降解实验及放线菌素D实验结果表明，circSEC31A的环状结构具有高度稳定性，不会被RNase R降解，且较SEC31A mRNA具有更长的半衰期，较持久的稳定性。

 

 

二、circSEC31A沉默可抑制胰腺癌细胞侵袭及迁移能力

PANC1 siR-NC组、siR-circSEC31A#1组，siR-circSEC31A#2组circSEC31A表达量分别为1.000±0.120、0.243±0.075、0.302±0.061；CaPan-2 3组circSEC31A表达量分别为1.000±0.109、0.325±0.063、0.224±0.059。两株细胞的siR-circSEC31A组circSEC31A表达量均显著低于siR-NC组，差异有统计学意义（F值分别为67.000、82.595，P值均＜0.001），表明circSEC31A可以被siR-circSEC31A有效沉默。

Transwell实验结果显示，PANC1、CaPan-2细胞的siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组穿膜细胞数均显著低于siR-NC组(表1)，差异有统计学意义，表明circSEC31A沉默后，PANC1及CaPan-2细胞的侵袭能力显著下降。

划痕实验结果显示，与PANC1 siR-NC组和CaPan-2 siR-NC组划痕区细胞覆盖率比较，PANC1 siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组和CaPan-2 siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组胰腺癌细胞划痕区细胞覆盖率均显著下调(表1)，差异有统计学意义，表明circSEC31A沉默后可抑制胰腺癌细胞的迁移能力。

 

三、circSEC31A通过与miR-200c-3p结合促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移

应用circSEC31A探针筛选miRNA的结果显示，PANC1、CaPan-2细胞circSEC31A富集的miRNA以miR-200c-3p为主（图1）。与oligo探针组比较，PANC1细胞circSEC31A探针组结合的 miR-200c-3p量显著增加（2.237±0.175比1.000±0.091），CaPan-2细胞结合的miR-200c-3p量也显著增加（2.166±0.156比1.000±0.153），差异均有统计学意义（t值分别为10.836、9.252，P值均＜0.001），提示circSEC31A在胰腺癌细胞中主要与miR-200c-3p结合。

 

 

 

 

为进一步验证miR-200c-3p在胰腺癌中发挥的生物学功能，设计靶向miR-200c-3p的siRNA转染胰腺癌细胞（siR-miR-200c-3p组）进行后续实验。Transwell结果显示，PANC1、CaPan-2细胞siR-miR-200c-3p组穿膜细胞数均显著多于siR-NC组、siR-miR-200c-3p＋siR-circSEC31A组，差异均有统计学意义（表2）。细胞划痕结果显示，PANC1、CaPan-2细胞siR-miR-200c-3p组划痕区细胞覆盖率均显著高于siR-NC组、siR-miR-200c-3p＋siR-circSEC31A组，差异均有统计学意义（表2）。提示沉默miR-200c-3p可促进胰腺癌细胞侵袭和迁移的能力，而沉默circSEC31A可显著削弱此促进作用。

 

 

四、circSEC31A通过miR-200c-3p/PDK1/Akt轴调控胰腺癌的侵袭及转移

利用RNAInter、mirPath和ENCORI数据库预测miR-200c-3p可能存在结合位点的下游靶基因，将所得的基因取交集后在KEGG数据库中进行通路富集分析，结果显示PI3K/Akt通路在所富集的通路中排名最高（图2）。此外，在PDK1的3′UTR序列中发现了与miR-200c-3p特异性结合的互补位点（图3），提示在胰腺癌细胞中PDK1是miR-200c-3p的下游靶基因。

 

进一步通过沉默胰腺癌细胞miR-200c-3p及circSEC31A的表达探讨circSEC31A对PDK1调控作用的影响。结果显示，PANC1、CaPan-2细胞siR-miR-200c-3p组PDK1 mRNA表达量均显著高于siR-NC组和siR-miR-200c-3p+siR-circSEC31A 组，差异均有统计学意义（P值均＜0.001，表3），提示沉默miR-200c-3p可上调PDK1 mRNA的表达量，而在此基础上进一步敲低circSEC31A可逆转上调PDK1的作用，表明circSEC31A是通过结合miR-200c-3p进而上调PDK1的表达。

 

 

蛋白质印迹结果显示，PANC1、CaPan-2细胞siR-NC组、siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组总Akt蛋白表达量差异无统计学意义；而siR-circSEC31A#1组和siR-circSEC31A#2组PDK1、p-Akt蛋白表达水平均显著低于siR-NC组，差异均有统计学意义（表4、图4），提示沉默circSEC31A可降低胰腺癌细胞中PDK1蛋白的表达进而使p-Akt蛋白的表达量下调。以上结果表明circSEC31A上调PDK1的表达，并特异性激活PI3K/Akt信号通路。

 

 

 

讨    论

近年来，circRNAs在高等真核生物疾病发生机制中的作用越来越受到重视。理论上，circRNAs的形成与线性mRNA中外显子跳跃相关，然而并非所有跳过的外显子都能产生circRNAs，还存在其他调节因子影响外显子跳跃后的环化过程。虽然circRNAs的表达丰度低于其线性RNA，但对于许多基因而言，circRNAs是主要的转录物，并且大多数产生circRNAs的母基因可能存在经典剪接和反向剪接间的竞争。circRNAs通常以特异性方式表达，广泛并稳定的存在于正常细胞和肿瘤细胞中，其表达的紊乱参与了肿瘤细胞增殖、侵袭、淋巴转移及化疗耐药等多个生物学的过程。由于具有共价环状结构的circRNAs对核酸外切酶活性有显著抗性，使其在体液中稳定存在，因此其具有作为肿瘤诊断、预后、疗效评估的生物标志物的潜能。本研究明确了胰腺癌细胞高表达circSEC31A，证实circSEC31A可促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移，并发现circSEC31A通过吸附miR-200c-3p上调PDK1的表达量，进而激活PI3K/Akt信号通路导致胰腺癌侵袭转移的发生。本研究首次报道了circSEC31A作为促癌基因在胰腺癌发生、发展中发挥的重要作用，提示circSEC31A可作为胰腺癌潜在的诊断标志物和新的治疗靶点。

miRNAs是一类小分子非编码RNA，主要通过与基因mRNA序列互补配对结合，在转录后水平调控其翻译和蛋白表达，进而影响肿瘤的进展。miR-200家族作为一个新兴的miRNA家族，已被证实对肿瘤细胞迁移、侵袭和转移具有良好的抑制作用。miR-200c-3p属于miR-200家族，参与细胞增殖、侵袭、转移、细胞凋亡和耐药性等多种肿瘤进展关键过程的调控；亦有研究指出，miR-200c可通过调节靶蛋白的表达进而抑制胰腺癌细胞的侵袭。然而miR-200c-3p在胰腺癌中发挥的作用机制迄今为止尚未见报道。本研究结果显示，circSEC31A在胰腺癌细胞中结合miR-200c-3p并拮抗其抑制功能的发挥，促进了胰腺癌细胞的侵袭及迁移。此外，沉默miR-200c-3p引起胰腺癌细胞迁移侵袭的促进作用可通过circSEC31A下调而逆转。提示miR-200c-3p可作为胰腺癌发生、发展中的抑癌基因，而circSEC31A通过竞争性结合并拮抗miR-200c-3p的抑癌作用进而促进胰腺癌的恶性进展。该结论为靶向干预胰腺癌侵袭转移能力提供了新的理论支持。

PDK1在多种癌症类型中表达失调，并参与细胞的各项生物学功能而影响肿瘤的进展，是癌症治疗中一个理想的干预靶点。此外，PDK1可调控PI3K/Akt、RAS/MAPK和MYC等多种重要信号通路，参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，与肿瘤的恶性程度及预后密切相关。既往研究表明，PDK1在胰腺癌人群中高表达，促进癌细胞增殖、生长和侵袭，与患者不良预后相关。本研究结果显示，miR-200c-3p通过直接与PDK1的3′UTR结合来下调PDK1的表达，而circSEC31A通过竞争性结合miR-200c-3p来上调PDK1的表达，进而激活PI3K/Akt通路，表明circSEC31A促进胰腺癌进展的分子机制是通过上调PDK1的表达，激活PDK1/Akt轴进行调控。

综上所述，胰腺癌细胞高表达circSEC31A,通过miR-200c-3p/PDK1/Akt轴促进胰腺癌细胞的侵袭转移，circSEC31A可作为胰腺癌潜在的防治靶点和评价肿瘤预后的重要指标，为探究胰腺癌发生和恶性发展提出了新的思路，为进一步开发胰腺癌治疗方案提供了理论基础。