【分子】0.3 CRISPR机理

三、CRISPR的作用机理

1. 外源基因组的捕获

        外源病毒或者质粒基因组侵入细菌体内，侵入基因组里的【前间隔序列（protospacer）】，会被Cas1/2蛋白剪切，插入CRISPR阵列前导序列的下游。

        Cas1/2识别前间隔序列下游的【前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）】，PAM位于前间隔序列的下游，3‘端。

为什么要有这一段儿呢，你直接识别前间隔序列它不香吗？实际上你想，如果识别序列本身的话，那就没法插入了。因为插入之后间隔序列就是细菌基因组的一部分了，那我Cas9切不切自己呢？对吧。细菌需要区分自身和外来的间隔序列，你要都给切了那完犊子了。你不能伤敌一百，自损八千对吧。

        前间隔序列插入的位置位于前导序列和相邻的重复序列之间，即在原先的CRISPR阵列里形成新的间隔序列。而新形成的间隔序列前面依然会有一段重复序列，重复序列永远跟在前导序列之后。

2. crRNA的形成

        我们说CRISPR阵列本质上还是基因，它总归是要转录的。还记得我们说过，前导序列负责它的转录。这里的转录产物是一段长RNA链，我们叫做pre-crRNA。这是一段完整的链，它包括了重复序列和间隔序列。所以你也能想出来，转录之后它们的命运就是被切断。

（1）I型和III型，有CRISPR特异性核酸内切酶，这个内切酶实际上也是Cas蛋白，你比如Cas6、Cas5d。

 （2）II型，例如Cas9。在Cas基因上游，操纵子前的部分，存在【反式激活CRISPR RNA基因（trans-activating crRNA gene）】，编码trRNA，trRNA能跟crRNA互补形成复合物，然后引导RNase III切割，使其成熟。

其实你会发现切断之后trRNA和crRNA实际上没有分开，二者结合成一个RNA了，叫sgRNA。small guide RNA，小向导RNA。当然现在人工合成直接就是一个省了一道手续，这我们后面再说。数数我们现在提过多少种RNA了，pre-crRNA、crRNA、trRNA、sgRNA。回去可以总结总结这些RNA的来源和功能，这是作业哈。考过这种题的，让你写比方说10种RNA的中文名，英文名和功能。别到时候想半天，就只能写出来转运RNA，那真就转不了运了。大家都知道多少种RNA哈？可以打在公屏上。

        总而言之，这里最终形成一段成熟的crRNA。这一段RNA就是间隔序列转录的最终结果。

3. 外源基因组的干扰

        成熟的crRNA和靶向序列互补，引导Cas9剪切目的基因组中的靶点，让双链断裂。

        成熟的crRNA中大概有20 bp左右的序列可以与带有PAM的靶向序列互补配对，进而引导Cas9剪切目的基因组中的靶点，让双链断裂。