唯一的植物双链DNA病毒——花椰菜花叶病毒
今天介绍的是唯一的植物双链DNA病毒——花椰菜花叶病毒。
简介
花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus，CaMV)是花椰菜病毒家族(卡利莫病毒/Caulimovirus)的成员，是感染植物的拟逆转录病毒。拟逆转录病毒像逆转录病毒一样通过逆转录复制，但病毒颗粒含有DNA而不是RNA。
病毒宿主
CaMV主要感染十字花科植物(如花椰菜和萝卜)，但一些CaMV毒株(D4和W260)也能够感染曼陀罗和烟草属的茄科物种。CaMV诱导多种全身症状，例如花叶、叶表面坏死病变、生长发育迟缓和整个植物结构的变形。 表现出的症状因病毒株、宿主生态型和环境条件而异。
CaMV由桃蚜等蚜虫以非循环方式传播。 一旦被引入植物宿主细胞，病毒粒子就会迁移到植物细胞的核膜上。
结构
CaMV粒子是一个直径为52 nm的二十面体，由420个衣壳蛋白(CP)亚基构成，这些亚基以三角剖分T=7排列，围绕着充满溶剂的中心腔。
CaMV包含一个8024bp的环状双链DNA分子，被逆转录过程中RNaseH作用产生的切口打断。 这些缺口来自tRNA-fMet和用于逆转录的两个RNA引物。进入宿主细胞后，病毒DNA中的这些单链“缺口”被修复，形成与组蛋白结合的超螺旋分子。该DNA被转录成全长、末端冗余的35S RNA和亚基因组19S RNA。
基因组
35S RNA的启动子是一个非常强的组成型启动子，负责整个CaMV基因组的转录。它因其在植物转化中的用途而广为人知。它导致双子叶植物中的高水平基因表达。然而，它在单子叶植物中效果较差，尤其是在谷物中。行为的差异可能是由于监管因素的质量或数量不同。最近的研究表明CaMV 35S启动子在一些动物细胞中也有功能，尽管使用的启动子元件与植物中的不同。虽然与经典动物启动子相比，该启动子的活性较低，但报告产物的水平很高。这一观察结果表明35S启动子可能具有用于动物的潜力。
该启动子因病毒转录本的沉降系数是35S而得名，其表达自然由该启动子驱动。它是使用最广泛的通用组成型启动子之一。它是在1980 年代初由蔡和洛克菲勒大学的合作者发现的。
35S RNA特别复杂，包含高度结构化的600 个核苷酸长的前导序列和6到8个短的开放阅读框 (ORF)。
紧随其后的是7个排列紧密、较长的ORF，这些ORF编码所有病毒蛋白。这些蛋白的表达机制是独一无二的，因为ORF VI蛋白(由19S RNA编码)控制多顺反子35S RNA上主要开放阅读框的翻译重新启动，这一过程通常只发生在细菌mRNA上。TAV功能取决于其与多核糖体和真核起始因子eIF3的关联。
ORF I – P1：运动蛋白
ORF II – P2：蚜虫/昆虫传播因子
ORF III – P3：病毒体相关蛋白(VAP)——结构蛋白，DNA结合能力
ORF IV – P4：衣壳蛋白(CP)
ORF V – P5：Pro-Pol——蛋白酶、双功能逆转录酶和RNaseH
ORF VI – P6：反式激活因子/病毒纤溶蛋白——包涵体形成/运输；可能还有其他功能
ORF VII/VIII – 未知(似乎感染需要注意)
包含一个tRNA-Met结合位点
除了在翻译激活和包涵体形成方面的功能外，P6已被证明与许多其他CaMV蛋白相互作用，如P2和P3，表明它也可能在某种程度上有助于病毒组装和蚜虫介导的传送。此外，P6已被证明与P7结合；研究两者之间的相互作用可能有助于阐明P7的未知功能。
P6的另一个功能涉及在感染过程中修饰宿主非病原体相关基因1(NPR1)。NPR1是水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)依赖性信号传导的重要调节剂，并且与两者之间的串扰最密切相关。NPR1 的修饰通过阻止SA依赖性信号传导来抑制植物细胞的防御反应；修饰后的NPR1可以正常运输到细胞核并结合PR-1启动子，但无法启动转录。因为SA的积累需要活性NPR1，这会导致SA的进一步消耗。P6修饰的NPR1对SA依赖性信号的调节定位于细胞核，而JA依赖性信号的调节本质上是细胞质的，并涉及COI1通路。与SA 相比，JA依赖性信号在修饰的NPR1存在下增加。
复制过程
CaMV通过逆转录复制：
1.病毒颗粒进入植物细胞并没有衣壳化。在这个阶段，病毒DNA由三个片段——α链、β链和γ链组成。它们不完美地组装成具有三个缺口(D1、D2、D3)的松弛环状DNA(rcDNA)。
2.病毒DNA进入细胞核，在那里填补了不连续性，形成共价闭合环状DNA(cccDNA)。此时病毒DNA也与宿主组蛋白结合，形成微染色体。
3.宿主RNA聚合酶从35S启动子转录，并绕到病毒基因组一圈，越过35S启动子后，转录停止 此外，转录也在19S启动子处启动。
4.病毒RNA进入宿主细胞质，在那里被翻译。其中，35S RNA不仅能作为翻译的模板，还是逆转录的模板。
5.tRNA-fMet的3'端与35S RNA的5'端附近的D1对应的位点结合。
6.tRNA-fMet通过病毒逆转录酶(由ORF V编码)引发新α链的合成。
7.RNaseH从DNA-RNA双链复合体中去除RNA，留下DNA。
8.新的DNA与RNA模板3'末端的35S启动子结合，α链的合成继续进行，RNaseH继续降解与DNA结合的RNA。
9.α链的合成结束，RNaseH活性在D3暴露富含嘌呤的区域，启动γ链的合成。
10.RNaseH活性在D2暴露富含嘌呤的区域，启动β链的合成。当DNA的新γ链到达新α链的5'端时，它会切换到新α链的5'端，重新创建D1。当 DNA 的新 γ 链到达新 β 链的 5' 端时，它会取代引物和一些新合成的 β 链，导致D2)的重新创建。当DNA的新β链到达新γ链的5'末端时，它会取代引物和一些新合成的γ链，导致D3的重新创建。
在这一点上，新的病毒基因组可以被包装到衣壳中并从细胞中释放出来，或者它们可以通过运动蛋白运输到相邻的未感染细胞中。
大多数转基因作物都使用花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)来激活人工插入宿主植物的外源基因。它以不同于存在于其天然芸苔属植物宿主中时所发现的形式插入转基因植物中。这使其能够在广泛的宿主生物环境中运行，否则这是不可能的。
CaMV包含8024 bp的双链DNA基因组并产生球形颗粒。CaMV感染是全身性的，当接种到磨损的植物表面时，甚至其DNA也具有感染性。CaMV基因组有8个紧密排列的基因，其中只有基因II和VII是非必需的，只有这两个基因可以被替换/删除而不会丧失传染性。此外，超过自然基因组大小(8024 bp)的修饰CaMV基因组也不会被包装到病毒粒子中。这两个因素严重限制了CaMV中可克隆的DNA插入片段的大小。据悉，细菌二氢叶酸还原酶DHFR基因已成功克隆到CaMV基因组中，替代基因II，并在植物中成功表达。
载体介导的CaMV传播的分子机制
该病毒是在蚜虫载体喂养期间从受感染的宿主获得的。为了发生，一个可传播的复合体由病毒粒子和位于载体探针中的蛋白质P2组成。 P2 N端结构域识别位于管心针尖端的蛋白质受体，P2 C端结构域与P3修饰的病毒粒子结合。
载体的获取模式由P2的组织和细胞内特异性定位控制。这种蛋白质仅存在于表皮和薄壁细胞中。此外，在这些细胞中，P2位于单个病毒电子透明包涵体(ELIB)中。在宿主细胞中，病毒蛋白P2和P3首先在众多病毒工厂(电子致密包涵体)中产生，然后在集中在ELIB之前输出并与微管共定位。CaMV专门利用微管形成可传播体，从而实现载体传播。没有进一步对该病毒进行完整的分子表征和研究。
逃避植物防御
花椰菜花叶病毒拥有多种机制，使其能够抵抗宿主植物细胞的防御。虽然前基因组35S RNA负责通过逆转录酶进行基因组复制，但它还包含一个非编码的600碱基对前导序列，作为重要的mRNA，用于产生参与病毒反防御的因子。许多CaMV宿主具有基于siRNA的病毒沉默机制，可用于限制病毒感染。上述600 bp序列的产物中，长度为21、22或24个核苷酸的病毒小RNA(vsRNA)用作诱饵、结合和灭活宿主沉默机制的效应子，例如Argonaute 1(AGO1)。这些vsRNA的实验性过度表达允许增加受感染植物中的病毒积累。
关于在转基因植物中使用CaMV 35S启动子的担忧
最近，人们对使用CaMV 35S启动子在转基因植物中表达提出了一些担忧，因为该启动子和P6的编码序列之间存在序列重叠。 经认证在美国发布的54个转基因事件包含高达528bp 的ORF VI(编码P6的C端结构域)。由于P6是一种多功能蛋白，其全部功能未知，因此有人担心其一个或多个结构域的表达可能会在转基因生物中产生不可预见的后果。 最近的研究试图确定什么长度的CaMV 35S启动子最不可能无意中产生P6域，同时仍保持完整的启动子活性。 正如人们所预料的那样，使用较短的启动子长度会减少包含的P6域的数量，也减少了产生不良影响的可能性。
总结
拟逆转录病毒分为两类：肝DNA病毒(Hepadnavirus)与花椰菜病毒(Caulimovirus)。有极小的概率，拟逆转录病毒会逆转录出丝状DNA/dlDNA，而不是开放环状DNA/rcDNA，逆转录病毒会有极小的概率，逆转录出环状DNA，泡沫病毒有20％概率包装dsDNA片段。这充分证明，世界上所有的真核细胞、细菌、真菌、dsDNA病毒和ssDNA病毒很可能是由拟逆转录病毒进化而来，而拟逆转录病毒很可能是由逆转录病毒进化而来。
下期介绍的是单链DNA病毒。
