日本狼与现代狗的关系最为密切，其祖先的基因组已被整个欧亚大陆东部的狗广泛遗传

摘要

日本狼（Canis lupus hodophilax Temminck, 1839）是灰狼的一个亚种

它居住在日本群岛，并在100-120年前灭绝。在本研究中，我们测定了19世纪至20世纪初的9只日本狼和11只日本狗的全基因组并分析了现代及古代的狼和狗。基因组学分析表明，日本狼是灰狼的一个独特亚种,在基因上与现代和古代灰狼都不同，缺乏与其他灰狼的基因流动

。一个最小化渐渗影响的系统发育树显示，在灰狼中，日本狼是最接近狗的单系群。此外，日本狼与欧亚大陆东部的狗有着显著的基因亲缘关系。

我们估算了在从更新世到全新世的过渡时期，东欧亚狗在与西欧亚狗谱系分化后的早期阶段发生了从日本狼的祖先到东欧亚狗的祖先基因渗入的水平。由于这种渐渗作用，许多狗通过东欧亚狗血统的混合而继承了日本狼的血统。由于这种遗传联系，在整个欧亚大陆东部，多达5.5%的现代狗基因源于日本狼相关的祖先.

介绍

灰狼（Canis lups）的系统发育引起了研究人员和公众的广泛关注，因为狼是人类最熟悉的动物物种之一，即狗的近亲。现存的灰狼（犬科狼疮）分为三个谱系：北美、欧亚和家养狗谱系，包括几个在更新世期间居住在欧亚大陆的现已灭绝的谱系（Ramos Madrigal，et al.2021）。最近对灰狼的系统基因组学分析表明，北美灰狼在基本祖先位置上分化，其次是欧亚血统（Fan等人，2016年；Leathlohair等人，2018年）。狗形成一个单系分支，是灰狼欧亚血统的姐妹群（Freedman等人，2014年；Fan等人，2016年；Leathlohair等人，2018年）。因此，狗的血统起源于欧亚大陆的假说已被广泛接受。但关于何时、何地、多少次以及来自哪个人口，仍有很多争论，狗的祖先是驯养的（伦纳德等，2002年；萨沃莱宁等，2002年；杰蒙普雷等，2009年；庞等，2009年；沃恩霍尔德等，2010年；拉森等，2012年；阿克塞尔森等，2013年；塔尔曼等，2013年；弗里德曼等，2014年；佩里2016年；詹森等，2018年；莱瑟洛夫等，2018年；佩里等，2021年）。由于没有任何现存的灰狼种群与狗的关系比其他狼种群更为密切，因此人们认为狗系是从已灭绝的灰狼种群驯化而来的（拉尔森等，2012年；塔尔曼等，2013年；弗里德曼等，2014年；斯科格隆德等，2015年；范等，2016年；弗兰茨等，2016年）。然而，目前还没有关于这种灭绝种群的信息。

欧亚大陆的许多地区，包括东南亚（Savolainen等人，2002年；Pang等人，2009年；Wang等人，2013年；Wang等人，2016年）、中东（Vonholdt等人，2010年）、中亚（Shannon等人，2015年）、欧洲（Thalmann等人，2013年）以及欧亚大陆西部和东部（双重起源）（Frantz等人，2016年）已被提议作为狗的起源候选地，但关于狗的起源（单一或双重）以及驯化时间的辩论仍在继续。据估计，欧亚灰狼和狗血统之间的差异发生在2万到4万年前（Skoglund等人，2015年；Botigué等人，2017年）。根据系统基因组学分析，狗最初被报道在基因上分为两个不同的谱系，即欧亚大陆西部和东部谱系（弗里德曼等，2014年；香农等，2015年；弗兰茨等，2016年；博蒂古等，2017年；Leathlobhair等，2018年）。随后的报告表明，北极雪橇犬谱系存在古老的分化（Sinding等，2020年），这与接触前的美洲犬密切相关（Leathlobhair等，2018年）。北极雪橇犬谱系与欧亚大陆西部和东部谱系之间的系统发育关系是相互矛盾的（Larson等人，2012年；Frantz等人，2016年；Wang等人，2016年），这些不一致的拓扑结构可以通过三个谱系分化后的高度混合或几乎同时分化来解释（Frantz等人，2016年；Zhang等人，2020年）。西欧亚和东欧亚血统在17000-24000年前分化（Botigué等人，2017年），而北极雪橇犬血统估计至少存在于9500年前（Sinding等人，202年）

研究表明，欧洲（Thalmann，et al.2013）、中东（Vonholdt，et al.2010）、中亚（Shannon，et al.2015）、西伯利亚（Sinding，et al.2020；Ramos-Madrigal，et al.2021）和东亚（Savolainen，et al.2002；Wang，et al.2016）的狼种群与狗一起经历了基因导入或双向流动（Freedman，et al.2014）。然而，从灰狼到狗的基因组渗入被认为是有限的，因为欧亚狼的存在对任何狗品种都没有表现出遗传亲和力（Bergström，et al.2020）。

日本狼（Canis lups hodophilax Temminck，1839）是灰狼的一个亚种，生活在日本群岛的本州岛、四国岛和九州岛，并在100-120年前灭绝（Ishiguro等人，2009）。线粒体基因组的分子系统发育分析表明，日本狼在现存灰狼分支的基础位置分化（Matsumura等人，2014年；Matsumura等人，2020年）。最近对大英博物馆藏品中的一只“本州狼”（日本狼的常用名称之一）进行的基因组分析表明，这只狼与西伯利亚狼的一个世系密切相关，该世系存在于晚更新世，并显示出与日本狗的显著基因交流（Niemann等人，2021年）。

在这项研究中，对9只日本狼（包括模式标本）和11只日本狗的基因组进行了新的测定和分析。分析表明：1）日本狼是灰狼的一个独特亚种，在基因上与迄今已知的现存灰狼和古代灰狼不同；2）日本狼与狗的一个单系群关系最为密切，3）日本狼的祖先在东欧亚犬在与西欧亚犬血统分离后的早期历史阶段就已经渗入到它们的祖先中，而源自日本狼祖先的基因组通过与东欧亚犬的在历史时期的混合从而被许多现代犬类继承，甚至在西欧亚血统中也是如此。

日本狼与其他狗和灰狼之间的关系在本研究中，确定了9只日本狼（22-282 Gb）和12只日本狗（70-127 Gb）的原始基因组DNA序列（表S1，图S1）。在本研究中，我们将九名具有日本狼型线粒体DNA单倍型的个体（Matsumura等人，2020）作为日本狼处理。此外，我们使用了数据库中覆盖深度>20倍的现代灰狼、覆盖率相对较高的古代犬科动物以及数据库中的外类群物种的测序数据（表S2）。所有序列数据均映射到参考基因组序列（CanFam3.1）。单倍型调用和gvcf文件合并后，对单核苷酸多态性（SNPs）进行基因分型。为了检验本研究中使用的个体之间的遗传关系，使用高覆盖率个体进行主成分分析（PCA）（图1A）。在PCA中，日本狼形成了一个独特的集群，这表明日本狼在基因上与狗、灰狼和任何外围物种都是分离的。灰狼被分为两组，即北美/北极组和沿PC1轴的欧亚组。狗沿着PC2轴呈东西向倾斜。在沿PC2轴的狗中，澳洲野狗和新几内亚唱歌狗（NGSD）与日本狼最接近，其次是一群日本狗（图1A）。使用相同的数据集，我们还生成了一个混合结果，在K=4时CV误差最低（图1B）。在这项分析中，日本狼也形成了K=5或K=6等K值较高的集群，这表明它们的遗传组成与其他狗和灰狼相比是独特的（图1B和S2）。接下来，我们在分析中加入了三只低覆盖率的日本狼[Leiden b和c，（Jentink 1887）和一只“本州狼”（Niemann等人，2021），见表S2]。PCA显示莱顿b和本州狼非常接近日本狼群，而莱顿c位于狗和日本狼之间的中间位置（图S3）。混合分析表明，莱顿b和本州狼与其他日本狼表现出相同的祖先模式，而莱顿c似乎与其他狗混合（图S4）。我们使用Patterson的f4统计数据（Patterson，et al.2012）来识别与莱顿c具有高度遗传亲和力的狗个体，以确定哪些狗群体是基因渗入的来源。与莱顿c亲和力最高的狗是日本狗Shiba（图S5A），莱顿c含有Shiba基因组的39%（图S5B）。相比之下，莱顿b与狗没有亲和力（图S5C）。这些结果表明，莱顿b和本州狼属于具有独特遗传成分的日本狼群，而莱顿c是日本狼和狗的杂交个体。随后，由于莱顿b、c和本州狼的覆盖率较低，我们将其从进一步分析中剔除。此前的一项研究（Niemann等人，2021年）表明，本州狼与西伯利亚狼的一个世系关系密切，该世系存在于晚更新世，很可能与狗混合。因此，我们将更新世狼添加到由现代灰狼和狗组成的数据集中，并进行了PCA（图S6）。更新世狼与欧亚狼关系密切，而日本狼则形成了一个独特的集群。我们的混合分析（图S4）表明，与其他日本狼个体相比，本州狼不包含更多的狗的DNA成分。Niemann等人2020年的结果与本研究之间的差异可能是由于分析中使用的日本狼数量和/或DNA测序覆盖率的差异造成的。

日本狼的系统发育位置

为了确定日本狼的系统发育位置，使用最大似然法（ML）构建了一个系统发育树（图2A）。在灰狼中，北美/北极个体首先在树的基部分支，然后是欧洲/中东和东亚灰狼（见图S7）。狗形成了一个单系分支，包括东欧亚、西欧亚和雪橇狗谱系（图2A、S7），如之前的研究所示（弗里德曼等，2014年；香农等，2015年；弗兰茨等，2016年；博提古等，2017年；Leathlobhair等，2018年；辛丁等，2020年）。日本狼形成了一个单系分支，它是狗的单系分支的姐妹群（图2A，S7）。日本狼和狗之间的姐妹群关系也得到了SVDQuartets推断出的树和基于状态身份（IBS）距离的邻居连接树的支持（图S8、S9）。使用outgroup-f3统计数据进行的分析（Patterson等，2012）还表明，在狼中，日本狼与狗的关系最为密切（图2B）。当我们进一步将狗分为亚群时，outgroup-f3统计显示野狗/NGSD和非洲狗之间的结果不同；野狗/NGSD与日本狼的关系最为密切，而非洲狗与中东灰狼的关系最为密切（图S10A和S10B）。狗群与日本狼的不同遗传亲和力可能是由于非洲狗和中东灰狼之间的渐渗造成的（Vonholdt等人，2010年；Bergström等人，2020年）。

由于系统发育分析中的树拓扑结构可能会受到分类群之间的渐渗的影响，因此使用具有最小渐渗效应的分类群的系统发育树有望最准确地表示种群分支。因此，为了获得这样的系统发育树，我们研究了日本狼和其他狗和狼之间的渗入。我们使用f3和f4统计数据比较了每只狗与日本狼的遗传亲和力，发现东欧亚血统的狗（图S7），尤其是澳洲野狗、NGSDs和日本狗，与日本狼表现出显著的亲和力（Z评分>3）（图2C，S11）。相比之下，西欧亚血统的狗，尤其是来自非洲的狗，对日本狼的亲和力较低（图2C，S11）。f4统计数据显示其他灰狼种群和日本狼之间没有较近的亲缘关系（图2D）。除日本狼和狗外，灰狼之间基因流动的可能性也通过f4统计进行了检验。中东地区的灰狼与狗显示出强烈的亲和力（图S12），符合以前的报告（冯霍尔特，等2010年；伯格斯特罗姆，等2020）。基于这些结果，我们重新进行了系统发育分析，以确认日本狼和狗之间的关系。为了尽量减少狼和狗之间的渗透效应，我们将非洲狗作为狗的唯一代表，并将中东灰狼排除在外。即使在从该分析中获得的系统发育树中，日本狼仍然与非洲狗形成姐妹分支（图S13）。因此，我们得出结论，与狗血统关系最密切的狼是日本狼。

现代家犬基因组中日本狼相关的基因

日本狼与许多东欧亚狗表现出强烈的亲和力（f3，f4统计）（图2C，S11），这可能是由于狗的基因渗入日本狼（日本狼或其祖先，以下简称“日本狼基因”）或反之亦然。最近的一份报告表明，从狗到灰狼的基因流动非常广泛，但从灰狼到狗的基因流动很少，这是因为灰狼与狗没有亲缘关系（Bergström，et al.2020）。我们使用f4比率研究了日本狼和东欧亚狗之间的基因流动方向（Patterson等人，2012年）。我们发现，从日本狼血统到狗的基因组渗入程度在野狗和NGSDs中最高（5.5%），其次是日本狗（3-4%），以及其他东欧亚血统的狗（图3A）相比之下，不支持从狗到日本狼基因组的基因组渗入（图S14）。通过f4统计，我们进一步分析了一小部分基因从狗向日本狼基因组渗入的可能性。如果狗的基因组被导入到日本狼的基因组中，那么日本狼和狗之间的基因亲缘关系在个体之间会有所不同。事实上，日本狼与dingo/NGSD的亲和力在个体间存在差异（图S15），Jw258、Jw269和Jw271对日本狗表现出显著的亲和力（图S16）。这种亲和力上的差异表明，日本狼的基因组中含有一小部分狗的基因组，而f4比率无法检测到.

从日本狼到狗的基因组渗入程度在东欧亚地区高于西欧亚地区。欧亚大陆东部的狗互相之间也有不同。这种差异可能是由于不同地区的日本狼和狗的祖先之间发生的多次基因导入事件造成的，或者是由一次基因导入之后，日本狼基因组扩散到不同的狗种群中。为了确定哪种假设更有可能，我们首先检查了不同区域的狗之间的基因流动程度。非洲狗和野狗/NGSD代表PCA中狗群的相对边缘（图1A），分别显示出与日本狼的最低和最高亲和力（图2C）。在狗中，非洲狗与野狗/NGSD的亲和力最低，而澳洲野狗/NGSDs与非洲狗的亲和力最低（图S17、S18）。根据澳大利亚野狗的线粒体DNA研究（Oskarsson等人，2012年），估计它们在4600年到18300年之间进入澳大利亚，考古证据支持至少在3500年前澳洲野狗就已到达澳洲（Milham和Thompson 1976年）。据认为，自那时以来，澳洲野狗一直在澳大利亚与世隔绝（Larson等人，2012年；Fan等人，2016年）。据估计，非洲狗在1.4万年前迁徙到非洲（Liu等人，2018年），此后一直被隔绝（Larson等人，2012年；Fan等人，2016年）。非洲犬和野狗/NGSD分别属于西欧亚和东欧亚血统（图S7）。因此，它们可能是各自家族中最古老的狗。f4统计双图显示，与野狗/NGSD亲和力较高的狗与非洲狗亲和力较低，而与非洲狗亲和力较高的狗与野狗/NGSD亲和力较低（图S19）。这种负相关表明，大多数狗群是通过欧亚大陆东部和西部血统（分别以野狗/NGSD和非洲狗为代表）之间的广泛混合形成的。事实上，通过f3统计的南亚和东亚的几类狗的基因组特征为野狗/NGSD与非洲狗的混合（Patterson等人，2012年）（图S20）

接下来，我们研究了不同地区的狗和日本狼之间的基因渗入程度。TreeMix分析表明，日本狼的基因在野狗/NGSD和日本狗的共同祖先时期渗入（图3B）。与野狗/NGSD和日本狼的f3双标图亲和力显示出正相关，表明日本狼基因已通过西欧亚和东欧亚狗的混合而变得广泛传播，并在东欧亚血统的现代基因组中持续存在（图3C）。因此，日本狼祖先的基因组很可能是在西欧亚犬和东欧亚犬分化后渗入东欧亚犬的一个祖先血统。随后，由于包含日本狼血统的东欧亚犬与西欧亚犬之间的混合，导致与日本狼的亲缘关系出现了差异。东南亚狗（图3C绿色）与日本狼的亲和力相比和澳洲野狗/NGSD的亲和力更高，这表明在首次混合事件后东南亚狗与未携带日本狼基因组的狗之间存在基因交流。类似地，日本狗（图3C蓝色）与野狗/NGSD的亲和力相比，与日本狼的亲和力更高，这表明日本狗和日本狼之间的存在后续的基因交流。因此，日本狼向狗的基因组渗入程度的差异很可能是由单一的渗入引起的，随后日本狼基因组扩散到不同的狗群中。

来自日本狼的基因组区域对日本狗的特征有贡献。f4比率分析的结果表明，秋田、柴犬和纪州犬含有36-45%的西欧亚狗的基因（表S3）。估计包含日本犬性状相关基因的基因组区域与西欧亚犬的基因组区域高度分化。如果这些区域与现代日本犬基因组中日本狼衍生的基因组区域（3-4%）重叠，则可能是日本狼衍生的基因导致了日本犬的特征性状。为了研究这些区域，我们使用fdM滑动窗口检测了来自日本狼的基因组区域，使用FST滑动窗口检测了日本狗和西欧亚狗之间的差异区域，并提取了重叠区域。发现了六个区域，包括四个基因和及其的上游或下游区域（图3D、图S21、表S5）。这些区域可能是来自日本狼的基因组区域的候选区域，这些区域有助于理解日本狗的特征。

讨论

日本狼在100年前灭绝之前很可能一直被隔离在日本群岛。这项研究表明，它们形成了一个单系类群，没有证据表明它们与其他欧亚灰狼有基因交流。日本狼的一个显著特征是它们的系统发育位置。在欧亚大陆，我们的系统发育分析表明，欧洲灰狼支系在基础位置分化，其次是中东和东亚灰狼支系。在东亚支系中，日本狼的单系群和狗形成了姐妹群关系。欧亚狼谱系的分化顺序是欧亚大陆从西到东的地理顺序。考虑到这些系统发育和地理关系，日本狼和狗很可能是在东亚发生分化的。换句话说，被驯化成狗的那个已经灭绝的灰狼种群与日本狼的祖先关系密切，可能居住在东亚。（拉森等人2012年；塔尔曼等人2013年；弗里德曼等人2014年；斯科格伦德等人2015年；范等人2016年；弗兰茨等人2016年）。这一假设并不直接意味着狗的驯化起源于东亚，也不直接意味着最早的狗是日本狼的后代。虽然驯化过程应该是从动物与人类的联系开始的（Larson等人，2012年；Perri 2016年；Janssens等人，2018年），但我们的系统发育分析没有提供证据表明狗的谱系何时开始与人类产生联系。在对古代“原始狗”种群的研究中，需要进一步的考古学证据来澄清狗与人之间关系的起源.

这项研究表明，很可能在东欧亚犬未分化时发生了日本狼基因渗入事件。据估计，家犬和欧亚灰狼之间的差异出现在2万到4万年前（斯科格隆德等人，2015年；博蒂古等人，2017年）。据报道，狗在其早期分化过程中分为西欧亚、东欧亚和雪橇狗谱系（Freedman等，2014年；Shannon等，2015年；Frantz等，2016年；Botigué等，2017年；Leathlobhair等，2018年）。因为9500年前的雪橇犬（Sinding等人，2020年）已经含有与现代雪橇犬相同比例的日本狼基因（2%：表S4），至少在9500年前更新世到全新世的过渡时期，东欧亚狗和西欧亚狗谱系分化后不久，在雪橇狗谱系建立之前就发生了日本狼的祖先向东欧亚狗谱系的基因渗入。NGSD(新几内亚歌唱犬)的基因中估计包含5.5%的日本狼成分。据估计，NGSD谱系在10900年前就已经存在（Bergström，et al.2020），这也支持了从日本狼的祖先向狗的渗透发生在更新世的假设。来自两个欧洲个体（4800年和7000年前）的古代狗基因组数据已经包含了约1.6%的日本狼基因组（表S4）。由于有报道称，从东南亚狗的祖先到这两种古代欧洲狗的祖先的基因流（Botigué等，2017年），日本狼的基因组可能在7000多年前通过东南亚狗的祖先传播给了欧洲狗。

虽然只在日本群岛发现过日本狼，但日本狼的祖先和东欧亚血统的狗之间的基因交流不太可能发生在日本群岛。与日本最老的狗（9600年前）（Shigehara和Hongo 2000年）的发掘同时期出土的一只西伯利亚古代雪橇狗（Sinding，et al.2020）已经拥有日本狼的基因组，这表明日本狼相关的古狼和东亚狗之间的基因交流发生在狗被带到日本群岛之前。因此，日本狼和东亚狗之间的基因交流很可能发生在东亚的某个地方。

基因中日本狼成分最高是澳洲野狗/新几内亚歌唱犬（5.5%）和日本狗（3-4%）。据推测，野狗/NGSD的高比例是由于它们被隔离在东南亚和澳大利亚的岛屿上，在那里它们避免了与来自西欧亚的狗混合。据估计，NGSD是两个谱系的混合产物（Bergström等人，2020年），因此其中一个混合谱系可能比NGSD拥有更高比例（约10%）的日本狼成分。相比之下，尽管高比例的日本狼成分存在于它们的基因组中,但是日本狗含有约36-45%的西欧亚基因（表S3）。因此很有可能在第一次日本狼相关的古狼与东欧亚狗发生混合后，在日本群岛又发生了一次日本狼与日本狗的基因交流。这一假设得到了日本狼和野狗/NGSDs亲和力比率的支持，日本狗的亲和力比率往往更高（图3C）。此外，在所有狗中，日本狗与日本狼的亲和力最高（图S16），这表明日本狼的基因在不久之前渗入到日本狗的基因中。

虽然现代狗的基因组中只有一小部分日本狼的基因组存在，但日本狼的基因可能会对狗的特征性状产生影响。我们在日本狗中寻找来自日本狼的基因区域，这些区域在日本狗和西欧亚狗之间高度分化。根据这些标准发现了六个区域（图3D、图S21、表S5）。尽管基因来自欧亚狗，但这些区域在日本和西欧亚狗的基因组中是有区别的。因此，这些区域有望在日本犬中被选择，并且是可能对日本犬的表型特征负责的基因区域的候选区域。进一步分析东欧亚狗中选择的区域，并对东欧亚狗的性状进行全基因组关联研究，应该可以揭示日本狼基因成分对狗的性状的影响。

在这项研究中，我们证明了日本狼是狗的单系分支姐妹群。我们最初的结果支持了这样一个假设:即现代家犬是从一个灭绝的灰狼种群驯化而来的（拉尔森等，2012年；塔尔曼等，2013年；弗里德曼等，2014年；斯科格隆德等，2015年；范等，2016年；弗兰茨等，2016年），而日本狼最接近这个现已灭绝的灰狼种群。此外，我们还估计了东欧亚狗中的与日本狼相关的祖先成分。因此，日本狼相关的基因可能涉及到了狗驯化的早期阶段。进一步分析日本狼和古代狗的基因组，特别是来自欧亚大陆东部的基因组，将继续揭示驯化狗的起源。