USP10通过稳定慢性粒细胞白血病中的SKP2来调节SKP2/Bcr-Abl轴

写在前面

        今天推荐的是由广州医科大学附属肿瘤医院及研究所在2019年4月30日发表于Cell Discovery（2020IF：10.850，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Jinbao Liu教授，研究表明USP10通过稳定慢性粒细胞白血病中的SKP2来调节SKP2/Bcr-Abl轴。

研究背景

        酪氨酸激酶Bcr-Abl的组成性激活是慢性粒细胞白血病 (CML) 发生和恶化的主要原因。目前，针对Bcr-Abl的酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 的应用是CML患者的主要治疗方法。然而，在长期给药过程中逐渐产生对TKI的获得性耐药性，使得TKI对晚期CML患者无效。因此，越来越多的研究集中在Bcr-Abl的扩增表达或激活上，这被认为有助于晚期阶段的治疗。

摘要部分

        在这里，作者展示了S期激酶相关蛋白 2 (SKP2) 通过介导其K63连接的泛素化和激活作为Bcr-Abl的共同调节剂。进一步的研究表明，USP10作为SKP2的新型去泛素化酶通过介导CML细胞中SKP2的去泛素化和稳定化来放大Bcr-Abl的激活。此外，USP10的抑制显着抑制伊马替尼敏感和伊马替尼抗性CML细胞的增殖，且与SKP2状态有关。这一发现在原代CML细胞中得到证实，因为这些细胞过表达USP10和SKP2，并且对USP10抑制剂敏感。总之，本研究不仅提供了对CML中Bcr-Abl放大激活的新机制，而且还表明靶向USP10/SKP2/Bcr-Abl轴是克服CML患者伊马替尼耐药的潜在策略。

研究内容

1.SKP2与Bcr-Abl相互作用，是Bcr-Abl激活所必需的       

        以前的研究表明，SKP2是Bcr-Abl的下游，促进CML细胞增殖。IM对Bcr-Abl激酶的抑制导致SKP2表达的显着降低和p27表达的增加。值得注意的是，与KBM5-T315I（突变）相比，KBM5细胞对IM处理更敏感，并且IM降低的Bcr-Abl和SKP2蛋白水平的磷酸化水平比KBM5-T315I细胞更显着，表明SKP2的改变是与磷酸化Bcr-Abl的水平一致。作者探究Bcr-Abl是否反过来需要SKP2的生物活性。作者发现SKP2与IM敏感的KBM5和IM抗性KBM5-T315I细胞中的Bcr-Abl相互作用并能够免疫共沉淀，并且这种相互作用不受IM的影响，表明这种相互作用与Bcr-Abl的磷酸化无关，SKP2可能在调节Bcr-Abl活性方面具有额外作用。     

        为了进一步检查SKP2在体内对Bcr-Abl的影响，作者使用SKP2 shRNA或SKP2-C25测试了SKP2的遗传或药理学抑制对CML细胞中Bcr-Abl磷酸化和整体表达的影响。 SKP2的遗传和药理学抑制显着降低了磷酸化Bcr-Abl及其下游信号的水平，包括磷酸化的 Crkl 和 STAT5，而总Bcr-Abl表达不受影响。此外，作者发现SKP2的抑制或丧失显着抑制了所有 K562、KBM5和KBM5-T315I细胞的细胞活力，表明SKP2参与了Bcr-Abl的激活，而与T315I突变无关。

        SKP2是E3连接酶之一，可以介导K48连接和K63连接的泛素化。由于抑制SKP2主要影响Bcr-Abl的活性但不增加其蛋白质水平，作者假设SKP2可能不会促进Bcr-Abl的蛋白水解降解，而是通过促进Bcr的K63连接的泛素化来增强Bcr-Abl的活性。实验结果表明SKP2的遗传或药理学抑制降低了Bcr-Abl的K63连接但不是K48连接的泛素化。此外，SKP2的过表达增加了Bcr-Abl的K63连接的泛素化水平。因此，所有这些结果表明SKP2介导了Bcr-Abl的K63连接的泛素化，这是Bcr-Abl激活所必需的。

研究结论：SKP2不仅充当Bcr-Abl的下游调节剂，而且还是对Bcr-Abl信号传导至关重要的协同调节剂。

2.USP10调节SKP2蛋白水平和Bcr-Abl激活     

        为了找出是否有其他DUB可以调节SKP2，作者通过Co-IP测定筛选了内源性SKP2与CML细胞中DUB之间的蛋白质相互作用。作者发现SKP2与KBM5-T315I细胞中的USP10、USP13、UCHL5、USP14 和 USP7 相互作用。作者进一步检测了敲低这些USP的HeLa细胞中SKP2的表达。只有USP10和USP13的敲低会降低SKP2的表达。发现内源性USP10在IM敏感KBM5和IM抗性KBM5-T315I细胞中结合SKP2。作者还在用 FLAG-USP10、FLAG-USP13 和 HASKP2质粒共转染的 HEK293 细胞中使用Co-IP验证了外源USP10和SKP2之间的相互作用。作者还发现USP10与SKP2的结合需要N端区域（1-205aa）。

        作者进一步探讨了USP10是否调节SKP2的表达。结果显示USP10的过表达增加了HEK293T和HeLa细胞中SKP2的蛋白质水平。为了探索USP10的去泛素化活性以富集SKP2，将野生型 (WT) 或催化失活突变体 (CA)USP10在HEK293T和HeLa细胞中表达。作者发现，只有USP10-WT增加了SKP2的蛋白质水平，这表明SKP2富集需要USP10的去泛素化活性。此外，结果显示USP10的缺失显着降低了CML细胞中SKP2的表达，以及Bcr-Abl的磷酸化和下游信号，表明USP10是SKP2表达和Bcr-Abl磷酸化所必需的。作者进一步研究发现USP10的缺失抑制了CML细胞的增殖并诱导了G0/G1期停滞，表明USP10对CML细胞增殖至关重要。

        此外，作者还评估了Spautin-1（一种USP10和USP13的选择性抑制剂）对人CML细胞中Bcr-Abl-SKP2轴的影响。值得注意的是，Spautin-1显着降低了SKP2的表达和Bcr-Abl的激活。此外，作者评估了Spautin-1对CML细胞的细胞周期进程或细胞死亡诱导的影响。结果显示，Spautin-1使CML细胞明显停滞在G0/G1期，但在K562、KBM5和KBM5-T315I细胞中没有发生凋亡，表明Spautin-1在不同肿瘤中引发了细胞系依赖性事件。MTS结果还显示，用Spautin-1对USP10进行药理抑制后，CML细胞的活力明显下降。这些数据共同表明，USP10通过靶向Bcr-Abl-SKP2-p27轴参与调控G1到S期转换。

研究结论：USP10调节SKP2蛋白水平和Bcr-Abl激活。

3.USP10去泛素化并稳定SKP2

        作者探究了在抑制蛋白质合成的放线菌酮 (CHX) 存在下USP10抑制对KBM5-T315I细胞内源性SKP2蛋白质水平的影响。使用Spautin-1对USP10的遗传或药理学抑制显着降低了内源性SKP2蛋白的稳定性，表明USP10在体内抑制了SKP2的降解。因此，作者研究USP10是否也作为SKP2的去泛素酶起作用。出乎意料的是，Spautin-1对USP10的药理学抑制显着增加了SKP2的多泛素化水平。此外，USP10通过其特定 shRNA的遗传沉默也丰富了SKP2的多泛素化水平。为了找出USP10介导的SKP2去泛素化是否抑制其降解，作者探究了Spautin-1或USP10 shRNA对K48多泛素化SKP2丰度的影响。作者发现Spautin-1和USP10 shRNA都显着增加了K48多泛素化SKP2的丰度。

研究结论：USP10可以作为SKP2的DUB，从而稳定CML细胞中的SKP2。

4.USP10缺失对增殖的抑制取决于SKP2的功能状态

        为了进一步确定USP10功能对SKP2状态的依赖性，作者接下来探究了在有无表达HA-SKP2质粒的情况下稳定表达对照 shRNA或 shUSP10的CML细胞中Bcr-Abl的激活。作者发现SKP2的过表达显着恢复了Bcr-Abl的活性，使其免受 shUSP10的抑制。一致地，shUSP10抑制的CML细胞增殖被SKP2的过表达恢复。此外，引入 WT SKP2而不是无活性突变体SKP2(S72A)显着恢复了K63相关泛素化的下调和由USP10抑制引起的Bcr-Abl失活，表明SKP2的S72对K63连接的泛素化和Bcr-Abl的激活。

研究结论：USP10的沉默或抑制可使Bcr-Abl失活并显示SKP2依赖性抗CML作用。

5.USP10的缺失或抑制了体内CML的生长

        作者接下来探究USP10的缺失或抑制是否会抑制体内CML异种移植物的生长。作者观察到，USP10敲低组的肿瘤重量和体积显着降低。同时，与载体组相比，USP10抑制组的肿瘤重量和体积，也显着降低。Western blot显示，与 Scramble异种移植物相比，稳定表达USP10 shRNA的异种移植物中SKP2的表达和Bcr-Abl的激活显着降低。此外，免疫染色结果证实，与Scramble组相比，稳定表达USP10 shRNA的异种移植物中SKP2的表达和Bcr-Abl的激活显着降低。

研究结论：USP10的药理学或遗传抑制对体内CML治疗有效。

6.USP10和SKP2在CML患者中上调

        为了确定USP10调节SKP2的临床相关性，作者对来自11名CML患者的原代单核细胞进行了USP10和SKP2的western blot分析。作者发现，与健康对照相比，CML患者的USP10和SKP2显着上调。为了进一步确定USP10是否可以成为这些患者的药物靶点，作者评估了Spautin-1对USP10的药理学抑制对 16 名CML患者的原代单核细胞的体外抗肿瘤作用。值得注意的是，Spautin-1显着降低了CML患者的原代单核细胞的细胞活力，其 IC50 值低于对照组。此外，用Spautin-1对USP10的药理学抑制也显着降低了这些患者中Bcr-Abl-SKP2轴的激活。作者随后检查了Spautin-1或不同浓度的IM对来自患者的CML细胞和原代单核细胞的细胞活力的影响。研究发现Spautin-1增强了IM在CML细胞系和患者原代单核细胞中的抗肿瘤作用。

研究结论：USP10和SKP2在CML患者的原代单核细胞中上调。

结论与讨论

        总之，作者的研究表明SKP2介导了K63相关的泛素化和Bcr-Abl的激活，以增强Bcr-Abl信号传导。此外，USP10是SKP2的新型DUB，它可能与USP13一起发挥作用，介导对抗泛素化和SKP2降解的对抗作用，从而确保SKP2的高蛋白质水平和增强的Bcr-Abl信号传导。作者的发现这为细胞周期控制的失调提供了新的见解。本研究还确定了以USP10为靶点治疗CML的潜在可行的治疗策略。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41421-019-0092-z