什么是单细胞测序

单细胞测序是指将新一代测序技术应用于单细胞，以表征其基因组、表观基因组和转录组。在过去的几年里，单细胞分析实际上彻底改变了我们研究复杂系统生物学的方法。事实上，标准的批量分析只能获得许多细胞的生物学细节的平均图像，因此失去了异质性信息。通过单细胞技术，我们可以揭示细胞之间的生物学差异，识别亚群以解开以前认为不变的组织中的多层异质性。通过这种方式，我们可以更好地了解单个细胞或一小部分细胞在其环境背景下的功能。

当然，这种分析需要大量的技术改进来克服处理如此少量的细胞和如此少量的基因组材料的限制。我们现在能够使用非常有限数量的起始材料和细胞数量，据此我们可以根据样品类型、系统复杂性和可用资源在不同平台和实验方法之间进行选择。因此，一个非常重要的参数是我们需要的吞吐量。有两种情况。我们可以处理低细胞数、低通量，例如在我们处理液体活检、一般活检或已分离的FACS分选细胞亚群的情况下。在这种情况下，我们将使用基于板的方法或集成流体回路。另一方面，我们还有另一种可能以高吞吐量工作。在这种情况下，微流体开始发挥作用。事实上，这种方法最近增加了单细胞分析的分析通量，一次对数千个细胞进行分析，不仅可以分析特定细胞类型，还可以分析整个组织。 

根据样本类型和系统复杂性，我们需要定义要分析的细胞数量，以便定义合适的细胞捕获平台。事实上，必须考虑样本的预期异质性和感兴趣的亚群的估计丰度。需要高细胞数，例如数千个细胞，一百万个细胞，在高度异质的样品和稀有亚群的情况下，例如在肿瘤样品或复杂组织的情况下，在这种情况下，我们应该选择微流控平台等高通量系统。相反，对于低复杂度的群体，我们还可以决定分析数百个细胞。

目前可用的技术是单细胞转录组学、基因组学和表观基因组学。第一种情况，单细胞转录组学。如果您想描述复杂系统的细胞组成，我们可以通过scRNA测序确定独特的分子谱。这是当今最常用的单细胞技术之一，也是因为它是所有单细胞方法中最稳定的。这种方法已被用于描述许多复杂的系统，例如大脑。以前发布的大多数数据也可以通过2018年推出的单细胞表达图谱来使用和询问，该图谱目前包括来自12个物种的123个单细胞RNA-Seq数据集.第二种情况是单细胞基因组学。基因组异质性是许多复杂疾病（如癌症）的标志，其特点是细胞亚群进化出不同的基因型和表型。单细胞DNA测序成功地揭示了多种癌症类型可以经历克隆进化，并识别与癌症进展有关的创始人突变和亚克隆突变。根据先前的知识和我们的生物学假设，我们可以在单细胞水平检测染色体拷贝数变异，成本可承受，但也可以使用全基因组单细胞测序或外显子组测序检测体细胞突变，但在这种情况下，与更高的测序成本和更高的分析相关复杂。第三种情况是表观遗传学。众所周知，表观基因组可塑性与许多生理过程有关，例如在癌症中具有非常重要的作用。事实上，我们知道在肿瘤发生、转移和耐药性进化过程中，癌症表观基因组发生了显着的重塑。由于靶向特定酶（如DNA甲基转移酶和组蛋白脱乙酰酶）的治疗药物已被证明可有效治疗多种癌症类型，这表明表观基因组改变在疾病进展中起关键作用。借助现在可用的单细胞技术，我们可以通过ATACseqDNA甲基化水平或组蛋白修饰转录因子与单芯片序列的结合来分析可接近的染色质。

让我们从技术角度看一下单细胞实验是如何进行的，基本上有五个步骤。当从复杂组织或液体组织（例如液体活检）开始时，我们要做的第一件事是分解或分离要分析的感兴趣的细胞，因为每个单细胞分析的起点都是获得单细胞暂停。当然，我们要使用的具体方法取决于我们要处理的样本类型，因此这取决于我们组织中细胞的丰富程度，我们是否要进行分析前富集，或者我们是否要保留空间信息。根据这些问题，我们将在显微操作激光捕获、酶解或机械解离之间进行选择。在我们得到这个单细胞悬浮液后，我们需要将每个单细胞分隔成一个反应容器。根据吞吐量，该反应容器可以是微孔板的孔或进入微流体装置的液滴。在这个微型反应容器中，所有的酶促反应都将发生。所以现在我们处于第三步，根据我们决定开始分析的特定组学，我们将继续进行例如DNA扩增或RNA说明和逆转录，然后我们将开始准备真正的NGS测序文库。然后这些样本准备好进行测序和分析，当然，在最后一步中，测序数据将根据我们决定的应用程序进行特定的生物信息工作流程，例如转录组分析或基因组分析。

现在让我们看看单细胞铬RNA分析的具体方案是如何工作的。铬方案的核心是将微流体与凝胶珠结合使用。凝胶珠在其表面涂有寡核苷酸，每个寡核苷酸由三部分组成。一个是特定的细胞条形码，它对于每个珠子都是唯一的，并且在不同的珠子之间是不同的一个独特的分子标识符，这将使我们能够在文库制备结束时分离和排除PCR重复，以及一个polyT故事以捕获多腺苷酸化的RNA这种珠子与油和细胞一起进入微流体然后细胞在这些微滴内与珠子一起被分隔，因为这些液滴内还有裂解缓冲液，细胞立即被裂解，RNA被释放并捕获在上述珠子上，这样每个细胞都是立即在转录组水平捕获，并且它们的转录组没有进一步的变化在收集完所有细胞数量之后，我们一开始就决定我们可以从适当的文库制备工作流程开始，这与标准批量处理非常相似。这是因为每个细胞在开始时都用细胞条形码进行了标记，这样我们可以在测序后在生物信息学水平上对包含该特定转录组的细胞信息进行反卷积所以在测序之后，我们最终会得到一组读取开始使用细胞条形码，然后是UMI和真实的转录信息，我们将使用细胞条形码信息来折叠细胞类型的读数，以便每个细胞都有其特定的转录组。然后我们将使用UMI信息来排除PCR重复，这样我们就可以得到所谓的数字表达矩阵，在这个矩阵中，我们对每个特定细胞都有所有已识别基因的表达水平。数字表达式矩阵我们执行一些QC和过滤。有了这些数据，我们使用聚类算法来产生某种可视化，例如tSNE或UMAP在这种图表上，每个点代表一个细胞，并且在转录组水平上它们之间更相似的细胞聚集在一起所以在一个单个UMAP我们可以看到我们可以观察到不同类型的群体这些群体的特征在于标记基因的特定子集。

现在让我们回顾一下最广泛使用的单细胞方法的一些实用建议，即单细胞RNA测序性能良好的scRNA-seq实验保持原生表达配置文件。因此，必须小心处理样品。每个组织都可能有特定的操作要求，在开始实际的单细胞实验之前必须对其进行测试。理想情况下，样品应在获得后立即处理，并尽可能减少操作以避免细胞死亡，这可能导致一些亚群的损失和大量的环境RNA，这可能导致伪影。有许多可用的协议描述了稳定和固定方法，例如基于使用DMSO或甲醇来克服这个问题。在scDNA或scATAC测序的情况下，起始材料是细胞核，因此在这种情况下，我们可以使用快速冷冻样品。然而，这种技术存在一些挑战，特别是，单细胞测序方法受到与所谓的丢失事件相关的高水平技术噪声的影响，即由于固有缺乏起始材料而没有观察到或计数为零的基因和无法捕获一些异常低丰度的转录本，这与我们在这种方法中使用的逆转录步骤效率低下和测序深度相对较浅有关。总而言之，单细胞分析领域正在迅速发展，现在的方向是将空间成分整合到细胞组成的描述中，以便更系统地描述器官的复杂组织。此外，多组学分析也将成为未来几年的关键词。