万物皆可皮尔逊！还可以做细胞坏死相关的miRNA，所有基因集（免疫，自噬，铁死亡等）都可以找相关的miRNA？

用于预测结肠癌预后的新定义的坏死性凋亡相关 miRNA 特征

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8763259/

从 TCGA 下载了 444 个 COAD 病例的 miRNA-seq 数据。我们鉴定了 8 种差异表达的 miRNA（has-miR-16-5p、has-miR-141-3p、has-miR-148a-3p、has-miR-425-5p、has-miR-7-5p、has-miR -223-3p、has-miR-200a-5p 和 has-miR-500a-3p），然后进行 Cox 分析以确定具有明显不同 OS 的八种 miRNA 特征预后生物标志物。预测 1 年、3 年和 5 年生存率的受试者工作特征 (ROC) 曲线的曲线下面积 (AUC) 分别为 0.663、0.653 和 0.639。多变量分析还暗示风险评分是考虑其他混杂因素的独立预后因素（HR = 1.847, 95% CI = 1.197–2.848, P = 0.006）。根据 Kaplan-Meier 分析，hsa-miR-500a-3p ( P= 0.003)、hsa-miR-16-5p ( P = 0.004) 和 hsa-miR-148a-3p ( P = 0.035) 显着影响 OS 结果。我们预测了这三种 miRNA 的靶基因，然后筛选了 10 个中枢基因（CCND1、SMAD3、SMAD2、CDK1、TGFB2、CDC25A、CHEK1、VEGFA、CCNE1、WEE1）。此外，CHEK1与生存预后相关。我们从 TCGA 下载了 miRNA 测序数据，筛选了 8 个差异表达的坏死性凋亡相关 miRNA。然后，我们使用 Cox 回归分析建立了坏死性凋亡相关 miRNA 的预测模型。最后，利用预后相关的miRNAs对靶基因进行预测，并通过功能分析探讨这些靶基因的潜在作用机制。我们的研究表明，坏死性凋亡与结肠癌密切相关，八种坏死性凋亡相关 miRNA 模型可能是结肠癌的预后生物标志物和治疗靶点。

结果

筛选差异表达的 miRNA

作为比较来自 TCGA 数据（457 个癌症样本和 8 个非癌症样本）的 13 个 miRNA 表达水平的结果，发现 8 个 miRNA 在表达上存在差异。肿瘤标本中所有 8 种 miRNA 的表达均升高，结果通过热图显示（补充图 1）。

构建基于 miRNA 的预后特征

我们将来自 TCGA-COAD 研究的样本与 427 名拥有完整生存信息数据的患者进行匹配。单变量 Cox 回归显示 5 个 miRNA（P值 < 0.05）与患者的 OS 相关（图 1A）。然而，考虑到所有差异表达的 miRNA 都具有临床意义，我们将所有 8 种差异表达的 miRNA 纳入进一步分析。图 1B）。因此，风险评分得出如下：miRNA 特征风险评分 = (0.307 × has-miR-141-3p exp ) + (0.151 × has-miR-148a-3p exp ) + (0.382 × has-miR-16- 5p exp ) - (0.411 × has-miR-200a-5p exp ) + (0.034 × has-miR-223-3p exp ) + (0.238 × has-miR-425-5p exp ) + (0.951 × has-miR- 500a-3p exp ) - (0.043 × has-miR-7-5p exp )。使用风险评分，427 个样本被平均划分为不同的风险亚组。根据 Kaplan-Meier 曲线，高风险组的 OS 较低（对数秩检验统计量 = 8.2，HR = 1.850，95% CI = 1.220–2.804，P = 0.004，图 2A）。通过 ROC 分析评估预后模型的敏感性和特异性，我们发现 1 年、3 年和 5 年生存率的 AUC 分别为 0.663、0.653 和 0.639。图 2B）。

miRNA 特征模型的独立预后价值

Cox 回归分析用于评估 miRNA 特征模型是否可用作独立的预后决定因素。单变量分析显示风险评分与 OS 相关（HR = 1.856, 95% CI: 1.206–2.856, P = 0.005,图 3A）。多变量分析还暗示风险评分是考虑其他混杂因素的独立预后因素（HR = 1.847, 95% CI = 1.197–2.848, P = 0.006,图 3B)，例如年龄、性别和 TMN 阶段。因此，该风险评分可用于评估结肠癌的预后。此外，TMN 分期也被认为是预后的独立指标（HR = 3.511, 95% CI = 2.230–5.528, P < 0.001）。

miRNA-靶基因分析

我们使用 Kaplan-Meier 曲线分析了八种 miRNA 对患者存活率的表达。从 hsa-miR-500a-3p（对数秩检验统计量 = 9.1，HR = 1.869，95% CI = 1.207–2.895，P = 0.003）、hsa-miR-16-5p的呈现中观察到对 OS 结果的显着影响(对数秩检验统计 = 8.5, HR = 1.869, 95% CI = 1.233–2.833, P = 0.004), hsa-miR-148a-3p (对数秩检验统计 = 4.4, HR = 1.555, 95% CI = 1.015– 2.382, P = 0.035) (图 4A–C）。根据来自三个数据库的数据，每个 miRNA 调节不同的靶基因。总共获得了539个基因作为三种miRNA的靶基因（图 4D）。为了探索 miRNA 和靶基因之间的关联，我们使用 Cytoscape 3.8.0 构建了这个动作网络，如补充图 2所示。该网络由 542 个节点和 591 个边组成，其中 hsa-miR-16-5p、hsa-miR-148a-3p 和 hsa-miR-500a-3p 分别对应 421、137 和 33 个靶基因。该网络中节点度的平均值和聚类系数的平均值分别为 2.2 和 0.0。基于 GO 富集和 KEGG 分析，我们确定了这些靶基因的生物学功能。GO分析共获得与结肠癌相关的靶基因338个术语（补充表2）。结果，显示了生物过程 (BP)、细胞成分 (CC) 和分子功能 (MF) 项的前 5 项的点图 (图 5A）。在这三类中，靶基因的BP变化主要集中在组蛋白修饰、腺体发育和去磷酸化；MF的变化主要富集于蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸激酶活性和SMAD结合，而CC主要富集晚期内体、转移酶复合物和含磷基团循环内体。结肠癌相关靶基因的KEGG通路分析显示44个结果（补充表3），其中≥20个主要富集于PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染、癌症中的MicroRNAs、MAPK信号通路和mTOR信号通路途径（图 5B）。

筛选中心基因

包含 498 个节点和 1931 条边的 PPI 网络复合体由 498 个靶基因组成。该网络的平均度数和聚类系数分别为7.8和0.2。通过 Cytoscape 3.8.0 及其插件筛选了十个中心基因（CCND1、SMAD3、SMAD2、CDK1、TGFB2、CDC25A、CHEK1、VEGFA、CCNE1、WEE1）（补充图 3）。这些hub基因的节点属性信息，如度、介数中心性、接近中心性和聚类系数，显示在表格1. 进行 Kaplan-Meier 分析以确定中枢基因表达如何影响患者的存活率，结果表明只有 CHEK1（对数秩检验统计 = 6.7，HR = 0.600，95% CI = 0.406–0.886，P = 0.010）对操作系统（补充图 4）。

讨论

研究表明，坏死性凋亡在癌症进展和转移中发挥着重要作用，基于靶向坏死性凋亡诱导因子的癌症治疗是癌症治疗的一种策略。18在目前的研究中，这是首次探索利用与坏死性凋亡相关的miRNAs来预测结肠癌的预后。本研究首先分析了结肠癌和正常组织中与坏死性凋亡相关的 13 个 miRNAs 的表达，然后构建了由 8 个 miRNAs 组成的预后风险评分，以评估这些坏死性凋亡相关 miRNAs 的预测价值。为了阐明这些明显影响患者生存的坏死性凋亡相关 miRNA 的机制，我们通过三个数据库预测了它们的靶基因。功能分析表明，差异表达的miRNA与PI3K-Akt和MAPK信号通路高度相关。

我们的研究产生了一个由八种坏死性凋亡相关 miRNA 组成的特征风险评分，并检测到它可以预测结肠癌的 OS。在肿瘤患者中，促肿瘤 miRNA 上调，抑癌 miRNA 下调。19转移性结直肠癌的进展和预后不良与循环中 miR-141-3p 水平的升高有关。据报道，miR-141-3p靶向PTEN，进而导致磷酸肌醇激活PI3K/Akt通路。20更重要的是，在用 LPS 处理的 Caco-2 细胞中，miR-141-3p 抑制 RIPK1 的作用，RIPK1 激活下游分子并促进坏死体形成，从而逆转肠上皮细胞损伤。15临床上，血清外泌体miR-425-5p水平与CRC的进展和转移密切相关，可通过激活PI3K/Akt信号通路、诱导巨噬细胞M2极化、增强上皮间质转化和分泌VEGF来调控PTEN促进肿瘤的发生。转移。21 , 22

MiR-7-5p 通过靶向线粒体蛋白 SLC25A37 和 TIMM50 介导线粒体损伤，从而诱导横纹肌肉瘤细胞凋亡和坏死性凋亡。23最近，lncRNA TINCR 可作为 miR-7-5p 海绵被提出与结直肠癌进展相关，这可能促进 miR-7-5p 介导的结直肠癌的发展。24 MiR-223-3p 对 RIP3 的表达进行负调控，显着影响 RIP3 介导的坏死性凋亡和炎症的抑制，从而减少脊髓神经元损伤。25 LINC00961作为抑癌基因，通过充当miR-223-3p海绵上调其靶基因SOX11的表达，抑制结直肠癌的迁移和侵袭。26与正常结肠黏膜相比，miR-200a-5p在结直肠癌中显着上调，但结肠腺瘤与正常黏膜无明显差异。27 , 28据报道，miR-200a-5p及其靶基因RNF11在心脏组织中存在差异表达，过表达的miR-200a-5p诱导RIP3依赖性坏死性凋亡。29

在我们的研究中，hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-16-5p 和 hsa-miR-148a-3p 的表达显着影响 OS 结果。研究表明，miR-500a-3p 可以与 MLKL 的 3′UTR 结合，30通过靶向 JAK/STAT3 通路的多种负调节因子，促进肿瘤干细胞的特性并驱动 STAT3 信号通路的激活。31虽然 MiR-16-5p 被认为是一种肿瘤抑制因子，32 , 33但它对结直肠癌的作用机制存在争议。34大肠癌患者血清和血浆中 miR-16-5p 的含量明显高于健康人，35在癌前病变患者的粪便中也观察到了类似的现象。36在结直肠癌中，抑制肿瘤启动子 miR-148a-3p 可以恢复 MHC-I 的表面水平，并通过促进钙连接蛋白的表达显着增强 CD8+ T 细胞介导的免疫攻击效果。37然而，一项研究报告称，miR-148a 的低表达与无病生存期和总生存期的显着降低有关，38表明 miR-148a-3p 与结直肠癌之间的机制并不精确。39

通过分析可访问的在线数据库，我们论证了上述三种 miRNA 的潜在靶基因和功能。靶基因主要参与组蛋白修饰、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性和SMAD结合，靶向PI3K-AKT和MAPK通路，在癌症的进展和转移中发挥重要作用。有报道显示，抑制 TIMP1 可通过调节 FAK-PI3K/AKT 和 MAPK 通路减少增殖和转移，但增加细胞凋亡。40据报道，大黄素通过 ROS 介导的 PI3K/AKT 诱导 RIP1 和 MLKL 的高磷酸化，从而诱导肾细胞癌的坏死性凋亡。41在胶质母细胞瘤中，作为 ROS-JNK-p53 环上游的 RIP1 和 RIP3，介导 PI3K/AKT/mTOR/P70S6K 的哺乳动物靶标，从而诱导坏死性凋亡。42

使用 Cytoscape 3.8.0 及其插件筛选出调节结肠癌 miRNA 的 10 个中枢基因（CCND1、SMAD3、SMAD2、CDK1、TGFB2、CDC25A、CHEK1、VEGFA、CCNE1、WEE1）。细胞周期蛋白是一组通过与细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 结合来调节细胞周期的蛋白质。43研究表明，CCND1 和 CCNE1 在正常和癌结肠组织之间差异表达，后者在 TNM 早期显着升高，与 OS 显着相关。44在上皮性卵巢癌中，miR-490-3p 通过靶向 CDK1 调节和影响 SMARCD1 和 CCND1 的表达。45 CDK1 可以与CCNB 形成CCNB/CDK1 复合物以控制G2/M 相变，并且对于启动有丝分裂至关重要。46CDC25A也是细胞周期相关基因，在多种癌症中过表达，通过调节癌细胞周期促进肿瘤进展，可能是有效癌症治疗的关键靶点。47 SMAD蛋白是TGF-β家族受体下游的信号转导分子。在来自不同来源的癌细胞中，酸中毒激活 TGF-β2，促进部分上皮间质转化，从而支持 SMAD2 乙酰化。48有大量证据表明 TGF-β2 在胶质瘤微环境中含量丰富，其诱导的自噬在胶质瘤侵袭中起着至关重要的作用。这种自噬还通过影响 SMAD2/3/7 的表达来启动胶质瘤中 TGF-β2 的反馈。49血管生成是肿瘤进展的必要条件。肿瘤细胞及其周围基质分泌的VEGFA在大多数人类肿瘤中过度表达，刺激内皮细胞增殖和存活，与肿瘤的侵袭、转移和预后密切相关。50与其他与 DNA 损伤反应 (DDR) 相关的激酶一样，WEE1 作为肿瘤抑制因子的主要生物学功能是防止 DNA 改变细胞复制。然而，越来越多的研究表明，WEE1 在各种实体瘤中过度表达，并且与预后不良有关。51

值得注意的是，CHEK1是必需基因，与患者的OS相关。Kaplan-Meier 表明，CHEK1 的高表达与更高的存活率有关。CHEK1 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是 DNA 损伤反应的重要调节剂。52因为它在 DNA 损伤中起调节作用，CHEK1 以前被认为是一种肿瘤抑制基因。然而，一项研究发现，CHEK1的差异表达和CHEK1 mRNA的降低是胃癌和结直肠癌的不良预后因素。53另一项研究表明，在结肠癌中使用特异性 miR 抑制剂治疗可降低高水平的内源性 DNA 损伤敏感 miR (DDSM)，增加 CHEK1 转录水平，这揭示了 CHEK1 对结肠癌的抑制作用。54

我们发现了一种新的 miRNA 特征风险评分，并分析了其对结肠癌预后的预测作用。我们没有条件收集自己的临床数据来验证我们的模型，这是我们研究的一个局限。另外，我们没有实验条件来验证这些miRNA和靶点的作用机制，这也是我们研究的局限。

结论

总之，我们的研究表明，坏死性凋亡与结肠癌密切相关，因为正常和结肠癌组织之间的 miRNA 表达存在差异。此外，我们的八种坏死性凋亡相关 miRNA 模型可用作结肠癌的独立预后分子标志物。在我们的研究中，我们发现了一种新的 miRNA 标志物，可以预测结肠癌的预后并帮助确定结肠癌的可靠治疗靶点。我们筛选的十个中心基因可能是靶向癌症治疗的有效靶点，尤其是 CHEK1。此外，它们有可能成为 CRC 的生物标志物。然而，需要更多的实验研究和临床试验来验证这些目标。

材料和方法

数据集

444 名 TCGA-COAD 患者的 miRNA 测序数据于 2021 年 9 月 28 日从 TCGA 数据库下载（https://portal.gdc.cancer.gov）。同时，获取了由466个文件（457个癌症样本和8个非癌症样本）组成的相应临床信息。此外，还从 TCGA 数据库中获得了 456 名 TCGA-COAD 患者的 mRNA 测序数据，用于枢纽基因的预测分析。

鉴定差异表达的坏死性凋亡相关 miRNA

我们从之前的评论中获得了 13 种坏死性凋亡相关的 miRNA，其中12种在补充表 1中给出。使用 R 语言 4.1.1 版“limma”包鉴定差异表达的 miRNA，P值 < 0.05。通过热图显示差异表达的miRNA的表达矩阵。

坏死性凋亡相关 miRNAs 预后模型的开发和评估

选择临床数据包括生存天数、生存状态、年龄、性别和 TMN 分类的患者。使用 Cox 回归分析，评估与坏死性凋亡相关的 miRNA 在 TCGA 队列中是否具有预测价值。从 TCGA 获得的所有差异表达的 miRNA 都包含在多变量 Cox 回归模型中，并使用“森林图”包显示结果。之后，将每个 miRNA 的乘积和系数相加并计算到风险模型中。

风险评分评估

TCGA-COAD 样本根据其中位风险评分分为两个亚组，然后使用 Kaplan-Meier 方法比较它们的总生存 (OS) 时间。使用“survival”、“ROCR”和“timeROC”软件包完成 1 年、3 年和 5 年 ROC 曲线。在提取了 TCGA 队列的临床参数，例如年龄、性别和 TMN 分期（I 或 II 与 III 或 IV）后，我们通过 Cox 回归模型将它们与风险评分进行了分析。

目标基因预测与功能分析

通过 miRDB、miRTarBase 和 TargetScan 预测与 OS 相关的 miRNA 的靶基因。同时，我们使用 R 语言版本 4.1.1 来识别所有三个数据库中的目标基因，我们还使用 Cytoscape 3.8.0 来绘制它们之间的关系。我们将“clusterProfiler”包应用于这些重叠基因，以进行 GO 富集分析和 KEGG 分析。17

枢纽基因筛选

STRING数据库用于构建基于miRNA靶点的PPI交互网络。据此，将网络相互关系文件导入Cytoscape 3.8.0，通过cytohubba获取hub基因。同时，通过Kaplan-Meier方法评估hub基因是否与OS相关。

统计分析

所有统计分析均使用 R 语言 4.1.1 版本和附属包完成。