神经退行性疾病｜蛋白聚集体研究案例分享

神经退行性疾病 蛋白聚集体研究

挑战及解决方案

9月21日是世界阿尔茨海默病日。至今全球约有5500万患者，平均每3秒就有1人患病。预计到2050年，这一数字将增加至1.39亿。阿尔茨海默病自1910年被命名后的一个多世纪，全球药企投入了超过6千亿美金进行药物研发。不幸的是，目前用于临床的针对性药物只有6款，而且只能延缓病情（来源：2021 Alzheimer's Disease Facts and Figures），其中最新上市的Aducanumab更引起了巨大的争议。

阿尔茨海默病成因较为复杂，目前尚无特别明确的机制。通过对大量病例及临床结果的分析研究，有多种不同的理论假说，其中广为接受并进行药物开发的有：遗传性机制、胆碱能假说、β-淀粉样蛋白假说、Tau蛋白假说等。例如Aducanumab是基于β-淀粉样蛋白假说而开发研制的一种单克隆抗体药物。不光是阿尔茨海默病，几乎所有神经退行性疾病的标志，或者说关键过程都是蛋白聚集。比如帕金森病中α-突触核蛋白，亨廷顿氏舞蹈病中突变亨廷顿蛋白聚集形成具有细胞毒性的斑块或缠结，引发神经元细胞的退化甚至死亡从而影响大脑功能。

因此，针对这些蛋白聚集体进行病理机制研究寻找生物标志物以及新的靶点，从而开发诊断示踪剂或治疗药物显得尤为迫切，而寻找能够特异性结合蛋白聚集体的配体分子更是重中之重。

   Why MST ?   

然而蛋白聚集体与配体（尤其是小分子）的相互作用检测却十分棘手。比如聚集体致病途径中，毒性最强的寡聚蛋白通常只在低浓度下形成，并且维持时间很短。此外，分子量较小的配体（如小分子化合物）结合到蛋白聚集体上所引起的信号变化很微弱。如果仅通过分子量变化检测，极易受到背景信号的干扰而产生假阴性的结果。

目前用于蛋白配体结合检测的常用方法有以下几种：ITC、THT、SPR。相比之下，MST 在研究蛋白聚集体时有着明显优势：

1 检测速度快，一对样品仅需10分钟

2 样品消耗量低，毛细管上样仅需10μl

3 灵敏度高，不仅仅依赖于单一指标，结合引起的分子量、电荷及水化层的变化都能检测到

在本系列中，我们将陆续和大家分享 MST 技术在神经退行性疾病机制研究、诊断示踪剂和抑制剂开发中的应用。今天介绍锌离子促进 Tau 蛋白纤维化的检测案例。

应用案例

MST 在蛋白聚集体与离子互作检测中发挥的作用

Tau 蛋白是一种微管结合蛋白（MAP），此前的研究认为过度磷酸化的 Tau 会形成神经纤维缠结，也有研究指出锌离子的结合会加速 Tau 蛋白的纤维化进程（图1）。因此，表征锌离子与 Tau 之间的相互作用，有助于我们进一步理解疾病发生的分子机制。但由于 Tau 蛋白可能会发生聚集，并且锌离子的分子量非常低，检测它们之间的相互作用非常困难。

使用 MST 技术成功检测到了 Tau 蛋白与锌离子之间的相互作用。图 3 为典型的 MST 结合曲线，呈现为“S”形。图 4 为 Tau 蛋白与锌离子的结合曲线，可以明显看到红框中高浓度的锌离子并未达到饱和，而是出现了另一段信号变化。在加入 5mM 的 EDTA 螯合锌离子后所有的变化均消失。这表明 Tau 蛋白与锌离子有多个结合位点且亲和力不同。

MST 技术不仅可以定量检测亲和力，还可通过原始曲线反馈溶液中样品是否存在聚集。如果 MST 曲线为图 5 所示的平滑曲线，则表明样品无聚集。如果 MST 曲线出现图 6 中的 “跳动”，则表明样品存在聚集，Monolith 的智能化软件会出现自动提示。

加入锌离子后立即上机检测（0min），此时的 MST 曲线平滑，表明溶液中无聚集体存在。而在孵育 20 或 40 分钟后，可以看到锌离子浓度大于 50 µM 时的 MST 曲线波动很大，表明 Tau 蛋白与锌离子孵育一段时间后发生了聚集，结果与文献一致 (Li et al., 2019)。

从应用案例中可以看出，MST 技术检测速度快，无需担心样品在检测期间发生变化从而影响结果。检测灵敏度高，不仅仅依赖于单一指标，成功表征了蛋白聚集体与离子间的相互作用。并且还能反馈样品聚集信息，这个功能是其他技术无法实现的。

NanoTemper 的分子互作检测仪 Monolith，旨在助力研究人员加速神经退行性疾病的药物开发流程。A future with no disease 更是 NanoTemper CEO 矢志不渝的愿景。

参考文献：

1. Kayed, R. et al. Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science 300, 486–489(2003) 

2. Zn2+Aggravates Tau Aggregation and Neurotoxicity. Li et al., Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 487