西北农林科技大学生命学院生物化学复习指南第11章 核酸性质及研究方法
第11章 核酸性质及研究方法
名词、符合、结构
DNase：脱氧核糖核酸酶，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。
RNase：核糖核酸酶，RNA水解酶，RNase H是一种核糖核酸内切酶，能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。
限制修饰系统：在细胞中，限制酶可降解外源侵入的DNA，但不降解经修饰酶甲基化保护的自身DNA,此为限制修饰系统。主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
Tm：DNA的热变性过程中光吸收达到最大吸收一半时的温度称为DNA的解链温度( melting temperature，简写Tm)或熔点
Southern-blot： Southern blot印迹法利用已知的DNA探针检测靶标DNA的存在及大小位置，Southern印迹法就是将电泳凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上后，再进行杂交。
Northern-blot 利用DNA或RNA探针将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜上再进行杂交。检测靶RNA的存在。
EB：溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。
PCR：聚合酶链反应体外扩增DNA技术，
ddGTP：双脱氧腺嘌呤核苷三磷酸。
简答题
影响Tm的因素有哪些？
答：DNA的均一性、G-C之含量、介质中的离子浓度。
影响质粒电泳行为的因素有哪些。
答：DNA分子的大小、胶浓度、电压、电极缓冲液、温度、碱基组成、溴化乙锭。
DNA双脱氧测序的原理
双脱氧测序原理，末端终止法—
答：聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列.
分子杂交技术的原理及应用。
答：应用核酸分子的变性和复性的性质，使两条来源不同的具有一定同源性（即具有碱基互补关系）的单链DNA分子或单链DNA分子与RNA分子经退火形成双链DNA分子或DNA-RNA异质双链分子(heteroduplex)的过程。三大分子杂交技术
Southern blotting
Northern blotting
Western blotting-- Western Blotting利用抗原抗体之间互补性结合的原理，利用酶连或其它方式标记的抗体检测靶抗原的存在及存在部位。
Southern blotting 和Northern blotting利用同源单链核酸分子可依据碱基配对原则形成异质双链的原理，通过放射性或非放射性方法标记一段单链核酸序列获得探针，检测与探针同源的核酸分子的研究方法。
DNA复杂度与复性速度之间的关系。
答：DNA的片段越大，复性速度越小，具有的重复序列越多福星速度越快。
核酸纯度鉴定方法？核酸分子均一性的鉴定方法？
答：测定OD260：OD280的比值来表示DNA的纯度
PCR技术的基本原理，关键步骤及应用。
答：原理：高温可以使DNA的双链解离形成单链，再通过引物与DNA模板结合，之后在TaqDNA聚合酶催化下DNA链延伸，合成与模板互补的子链，最终形成新的DNA。
基本步骤：设计一对引物以便有效扩增所需的DNA序列，并尽可能减少产生的非特异性产物；选择三个温度进行热循环：变性（使DNA双链解离形成单链）、退火（低温下引物与模板DNA互补区结合）、延伸（中温下，在DNA酶的催化下以引物为起点的DNA链的延伸。）；扩增完成后取出一定产物，检测扩增结果。
应用：病原体的检测、法医和刑侦鉴定、癌基因的检查、基因探针的制备、基因组测序和染色体巡视、cDNA库的构建、基因突变的分析和定位诱变、DNA重组、基因的分离和克隆、遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的产前检查。
1、模板DNA 2、寡核苷酸引物 3、dNTP 4、Taq 5、缓冲环境、合适的温度
Southern blot 的基本流程。
答：将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。将胶浸泡在碱（NaOH）溶液中使DNA进行变形，然后将变性转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性DNA），在80摄氏度焙烤4~6小时，使DNA牢固地吸附在硝酸纤维素膜上。然后与放射性同位素标记的变性DNA探针进行杂交。杂交需在较高的盐浓度及适当的温度（一般68）下进行数小时或十余小时。然后通过洗涤，除去未杂交上的标记物。将硝酸纤维素膜烘干后进行放射自显影。
