生信分析铁死亡+简单实验
Front Mol Biosci 期刊上，影响因子为5。
糖尿病肾病是糖尿病的一种严重并发症，也是导致肾衰竭的主要因素。其特点是进行性肾功能损害、肾小球滤过率恶化、血清肌酐水平升高、高血压和高死亡率。然而，这两个指标的特异性和可靠性都很有限。近年来，研究人员探索了与 DN 的发生和发展相关的各种生物标志物和分子途径。DN 的一个研究领域是对铁凋亡的研究。
1. 数据归一化和差异表达基因（DEGs）分析
GSE30122 数据集是从 GEO 数据库下载的，其归一化结果如图 1A 和图 B 所示。对数据集进行预处理后，确定了 392 个 DEGs，其中上调基因 188 个，下调基因 204 个（图 1C）。FRGs 来自 GeneCards 数据库。根据 GeneCards 数据库，51 个 FRGs 被鉴定为 DEGs（图 1D）。
图1 数据预处理和 DEGs 筛选
2.不同表达的 FRGs 的 GO 和 KEGG 分析
GO富集结果显示，这些基因主要参与凋亡信号通路、细胞对氧化应激和化学应激的调控（图2A、B）。KEGG分析显示，这些基因主要与血脂和动脉粥样硬化、p53信号通路和mTOR信号通路有关（图2C和D）。
图2 差异表达的 FRGs 的 GO 和 KEGG 富集分析
3.差异表达的 FRGs 的 GSEA 分析
如图 3A、B 所示，作者通过 GSEA 发现，与对照肾脏相比，DN 肾组织中的多个生物学通路发生了显著变化。作者使用 R 软件包 "UpSetR "研究了与 KEGG 通路相关的模块（图 3C）。"表皮发育"、"角质化 "和 "皮肤发育 "是Top3富集的通路（图3D）。
图3 差异表达 FRGs 的 GSEA 富集分析
4. 对差异表达的 FRGs 进行 PPI 分析
为了更好地阐明差异表达基因之间的相互作用，作者使用 STRING 数据库进行了 PPI 网络分析（图 4A）。然后，作者应用 Cytoscape 的两个插件 MCODE 和 CytoHubba 筛选基因（图 4B、C）。两种结果交集后，10 个差异表达的 FRGs 被确定为关键基因（图 4D）。
图4 PPI 网络的建立和中心基因的鉴定(A) PPI 网络
5. DN 诊断生物标志物的鉴定和评估
利用 LASSO 回归和 SVM-RFE 筛选关键基因，以确定 DN 的诊断生物标志物。通过 LASSO 回归得到了六个重要变量（图 5A、B）。利用 SVM-RFE 算法得到了八个特征（图 5C）。将这两种方法得到的结果相交后，得到了六个重叠的中心基因（图 5D）。这六个中心基因分别是 TP53、RB1、NF2、RRM2、PRDX1 和 CDC25A。图 5E 显示了这六个中心基因的评估结果，TP53、RB1、NF2、RRM2、PRDX1 和 CDC25A 的 AUC 值分别为 0.751、0.705、0.725、0.882、0.691 和 0.675。最后，作者将这六个基因确定为 DN 的铁突变相关诊断生物标志物。TP53、RB1、NF2、RRM2、PRDX1 和 CDC25A 被建立为 DN 的诊断模型。利用 ROC 曲线对诊断模型进行了评估，训练集的 AUC 值为 0.939（95% CI：0.863-0.993），验证集的 AUC 值为 1.000（95% CI：1.000-1.000）（图 5F、G）。
图5 DN 生物标志物的鉴定和评估
6.DN 诊断生物标志物与浸润免疫细胞的关联
研究检查了对照组和 DN 样本中浸润的免疫细胞，发现免疫细胞存在显著差异（图 6A、B）。接下来，作者研究了 DN 样本中免疫细胞浸润与 TP53、RB1、NF2、RRM2、PRDX1 和 CDC25A 的关系（图 6C）。
图6 免疫细胞浸润评估
7.这六种生物标记物的表达与验证
方框图用于直观显示训练集中这六种生物标志物的表达水平。图 7A-F 显示，与对照组相比，DN 组中 TP53、RB1、NF2、RRM2 和 PRDX1 的表达水平显著增加。相反，DN 组 CDC25A 的表达水平明显下降。为了验证结果，作者通过 qRT-PCR 检测了它们在人体正常肾组织和 DN 组织中的表达水平。图 7G 中显示的结果与训练集中的结果一致。
图7 这六种诊断标记物的表达和验证
8.TP53 通过 PI3K-AKT 信号通路促进 DN 细胞凋亡
TP53 是 DN 诊断指标中折叠变化差异最大的基因。因此，作者接下来探讨了 TP53 对 DN 的影响。通过 Western 印迹分析确定 PI3K-AKT 信号通路中信号蛋白的表达，包括 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR 和 p-mTOR。结果表明，与对照组和 DN 组相比，si-TP53 组和 DN + si-TP53 组的 PI3K-AKT 信号通路分别被激活（图 8A）。此外，与 DN 组相比，si-TP53 可显著增加 c-PARP 和 c-Case-3 的表达（图 8B）。作者使用 LY294002 进一步抑制了 PI3K-AKT 信号通路，观察到与 DN 组相比，细胞凋亡受到明显抑制。然而，si-TP53 逆转了 DN-si-TP53 + LY294002 组的细胞凋亡过程（图 8C）。
图8 TP53 通过 PI3K-AKT 信号通路促进 DN
总结
总之，作者利用生物信息学工具分析了 GEO 数据库中的 DN 数据，从而发现了 DN 中与铁突变相关的潜在分子靶标。此外，作者还建立了一个与铁突变相关的 6 个基因模型，该模型对 DN 具有极佳的预测性能。最后，qPCR 和 Western 印迹分析证实，TP53 通过 PI3K-Akt 通路促进细胞凋亡，最终导致 DN。
