Pull-down实验技术大盘点
前面小恒用了几期干货分别介绍了免疫沉淀及相关技术，包括免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫共沉淀（ChIP）、RNA免疫共沉淀（RIP），这些都是用于分析细胞内蛋白与蛋白、蛋白与DNA、蛋白与RNA互作的经典技术方法，以抗原—抗体之间特异性结合为基本原理实现的技术。另一种类似的蛋白互作的研究方法—pull-down实验，即拉下实验，也称为体外蛋白结合实验，可以确定已知蛋白和未知蛋白间的互作关系。这两种技术均能检测蛋白间的相互作用且都是定性分析，没法确定瞬时互作情况，从原理到应用、以及实验上都存在一些区别。下面给大家具体介绍一下pull-down实验，以及相关的延申技术—DNA pull-down和RNA pull-down。
Pull-down实验基本原理
Pull-down通过将已知蛋白作为诱饵蛋白，用生物素-、PolyHis-或GST-等标签对其进行标记，然后将诱饵蛋白固定在与其亲和的固相支持物上充当诱饵，与蛋白样品或细胞/组织裂解液共孵育，可捕获样品中与诱饵蛋白互作的蛋白，接着通过洗涤或洗脱过程去除其余物质，并将捕获的蛋白回收，进行WB或质谱等检测分析。其中诱饵蛋白和目的蛋白的获取方法相对简单，均可通过裂解细胞、纯化蛋白、表达系统或体外转录/翻译等方法获得。
为了使pull-down技术更高效且易于应用，研究人员将待捕获的目的蛋白与特定的蛋白标签融合表达，而诱饵蛋白则可以与标签结合，进而捕获目的蛋白，目前pull-down中应用最为广泛的融合标签是GST（glutathione-S-transferase，谷胱甘肽-S-转移酶），此外6×His标签等也可以。为了方便后续检测鉴定，待捕获蛋白也可以融合Flag、HA或Myc标签，通过检测标签反映捕获蛋白的情况。
GST pull-down
基于GST融合蛋白发展起来的pull-down技术称为GST pull-down，这得益于Smith团队在1988年从细菌中纯化出GST融合蛋白，之后逐渐发展为如今研究蛋白互作最常用到的方法之一。GST可以与GSH（谷胱甘肽）结合。GST pull-down的基本原理是将GST融合蛋白作为诱饵蛋白，可与固定在固相支持物上的GSH结合，当把目的蛋白样品经过时，即可得到与诱饵蛋白互作的目的蛋白。再通过分离洗脱结合物，进行WB分析，从而证实两种蛋白间的互作关系或纯化出相应的目的蛋白。GST pull-down技术的应用主要包括两个方面，一个是与WB实验结合验证两种已知蛋白的直接互作关系，另一个是与质谱结合寻找可能与已知蛋白存在相互作用的未知靶蛋白。
GST pull-down一般实验流程
（1）体外表达GST融合蛋白；
（2）纯化GST融合蛋白，并固相化；
（3）制备待捕获蛋白，可以融合His标签进行原核表达，也可融合Flag/HA/Myc等标签进行真核表达。若是未知蛋白，直接使用细胞裂解液即可。
（4）pull-down实验，即将蛋白样本与固相化的GST融合蛋白共孵育；
（5）洗涤除去未结合蛋白等其它物质，洗脱目的蛋白；
（6）WB鉴定或SDS－PAGE电泳后进行质谱分析。
DNA pull-down
DNA pull-down技术是一种研究体外DNA与蛋白互作的有效方法。与pull-down不同的是，这项技术是以特定DNA序列作为探针，研究或寻找与之相结合的蛋白，常应用于检测鉴定转录因子或组蛋白等。通常将DNA探针与生物素偶联，生物素与链霉亲和素间以高强度的非共价结合，可将DNA探针固定，以便捕获互作蛋白。
DNA pull-down一般实验流程
（1）设计并制备DNA探针及标记：以基因组特定DNA序列作为模板，可通过化学合成或PCR扩增等方法获得，然后使用生物素等标记物对DNA探针进行修饰。
（2）将DNA探针固定到固相支持物上，常见的有结合有链霉亲和素的磁珠或琼脂糖珠。
（3）表达/提取目的蛋白或蛋白样品，样品可以是细胞/组织裂解液、纯化的蛋白。
（4）DNA pull-down，将蛋白样品与固定的DNA探针一起孵育。
（5）洗涤除去非结合蛋白，分离纯化目的蛋白。
（6）目的蛋白的检测分析，如WB和质谱。
RNA pull-down
RNA pull-down技术则是研究RNA与RNA结合蛋白（RBP）间互作的主要方法之一。RNA与RBP的互作是基因表达调控、细胞功能调节等生命活动的重要一环，在生理和病理过程中都扮演者重要角色。同样的，RNA pull-down以RNA探针作为诱饵去捕获RBP，进而对RBP进行鉴定，或寻找未知的RBP。
RNA pull-down的基本原理是通过体外转录的方式获得生物素标记的RNA探针，然后与蛋白样品共孵育，形成RNA-蛋白复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，通过生物素与链霉亲和素的非共价亲和作用，使其与孵育液中的其他物质分离。得到的RBP是已知的情况下，通过WB检测RBP与RNA的互作关系；若是未知的RBP，则结合质谱对结合的未知RBP进行鉴定分析。
RNA pull-down一般实验流程
RNA pull-down的实验流程与DNA pull-down差不多，主要区别于探针的获取方法：
（1）制备特定RNA探针并做生物素标记，通RNA探针过体外转录方法制备。
（2）RNA探针固相化。
（3）获取蛋白样本，并与固定的RNA探针孵育。
（4）洗脱分离RBP。
（5）对RBP进行WB或质谱分析。
Pull-down相关技术与免疫沉淀相关技术的区别
综合前几期内容和本文介绍的pull-down实验，它们存在一定的区别，主要包括以下几个方面：
（1）免疫沉淀及相关技术可用于检测研究体内蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA之间的互作，可真实、完整地反映它们之间的互作关系；而pull-down及相关技术则反映是在体外结合状态而不是体内自然结合的状态，无法得知真实的蛋白互作情况，因此可能出现假阳性结果。
（2）免疫沉淀及相关技术得到的蛋白复合物可能存在一些非特异性黏附蛋白，因此不能直接证明蛋白间的直接互作关系，也可能是间接的结合的；pull-down可以排除其它蛋白的影响，直接反映目的蛋白和待检测蛋白是否直接发生相互作用。
（3）还有一点是，pull-down可以作为免疫共沉淀的进一步验证方法，判断蛋白间是直接或作还是间接互作。
大家选择实验方法时要注意不同方法有不同的应用范围，论证的结果也不同，因此要对一些相似的研究方法进行区分，希望这几期内容能对大家有所帮助。至此，免疫沉淀和与其类似的pull-down技术就介绍差不多了，下期咱们再聊聊这些实验中所使用的抗体，这也是实验成败的关键之处，欢迎继续关注。汉恒生物专注病毒包装十余年，有丰富的实战经验，有多种蛋白标签可供选择，以满足不同实验对标签使用的需求，如有产品需求或技术问题，欢迎联系咨询~
