NGS工作者必读：你不得不知道的接头那些事

2023-03-13 15:58 作者:上海迪赢生物 0人读过 | 我要投稿

接头（Adapter）是二代测序文库的必不可少的组成部分，是待测DNA片段与测序芯片（Flow cell）连接的桥梁。接头的连接效率是影响文库的质量和产量的重要因素。UDI接头（Unique Dual Index）可以大幅度降低illumina测序过程中因为机器测序或者实验过程中引入的交叉污染，从而尽可能避免测序数据“张冠李戴”的现象，提升变异识别准确性。UMI接头可以通过SSCS和DCS校验，剔除由于PCR扩增和测序错误引入的假阳性，提高低频突变的检测准确性。

什么是接头？

接头是一段序列已知的短核苷酸，以illumina测序平台为例，可以分为3个部分：第一部分是P5/P7端（下图紫色框），与测序芯片（Flow cell）中的oligo P5/P7序列呈互补状态。这段序列可以将待测片段固定在Flow cell上进行桥式PCR扩增；第二部分是Rd1 /Rd2 SP（Read1/Read2 sequencing primer）（下图绿色框），是Read1和Read2测序引物结合的位置；第三部分是index1/index2（下图红色框）又称为barcode，目的是给文库加上特定的标签，用于混合文库测序时区分不同的样本。

接头的类型

以illumina的接头为例，illumina的接头是一个精巧的设计，呈“Y”字型。根据接头是否可以做PCR-free建库，可以将接头分为长接头和短接头。

长接头又称为完整接头，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2 SP。长接头通过TA克隆的方式连接到待测DNA片段两端，不需要PCR扩增即可直接上机测序（当文库量不够时还是需进行PCR扩增，使得产物达到一定的浓度，方可上机测序）；短接头也是通过TA克隆的方式连接到待测DNA片段两端，但是连接产物的结构并不是完整的illumina文库，必须使用与短接头互补且带有P5/P7序列的引物进行PCR扩增，形成包含完整接头的文库，才能上机测序。U型接头本质上也是短接头，但是形状不同，需要在接头连接之后做一步处理，将修饰碱基切开。

UDI的作用

在经历了若干年的发展之后，illumina测序公司将测序平台由随机（Random）芯片变成为阵列式（Patterned）芯片，并且搭配排他性扩增（ExAmp）成簇技术，使得通量更高，成本更低，同时也出现了一个标签跳跃（Index hopping）问题。为了解决该问题，illumina公司提出“Prepare dual Indexed libraries with unique Indexes”的策略，即在文库的P5和P7两端分别添加唯一标签—UDI（Unique dual Index）。两端Index交叉验证，从而能够有效降低Index错误分配的可能性。此外，UDI还可以大幅度降低illumina测序过程中因为机器测序或者实验过程中引入的交叉污染以及测序误差导致的串扰。

UMI的作用

除了减少index的串扰外，一些逐渐兴起的检测领域也对测序的准确度提出了更高的要求。肿瘤的液体活检具有广阔的市场前景，但是想检测到cfDNA中含量极低的ctDNA，目前测序仪99%的测序准确度是远远不够的。为了提高低频突变的检测准确性，避免假阳性，可以在UDI接头的基础上引入UMI分子标签。通过对原始待测DNA进行标记，可以知道哪些reads是来源于同一条原始的DNA分子。使用这些reads互相校正，就可以排除PCR扩增和测序时的错误，只保留了真正的突变。