qPCR 检测的工作原理

在解释 qPCR 的工作原理之前，我们想简要概述一下它与标准 PCR 和 RT-PCR 的区别。

标准 PCR 在反应完成后监测 DNA 扩增，而 qPCR 使用荧光信号在反应进行时监测 DNA 扩增。 这就是为什么 qPCR 也称为实时 PCR、定量 PCR 或定量实时 PCR。

RT-PCR，不要与实时 PCR 混淆，代表逆转录 PCR，可用于扩增 RNA 目标序列。 它涉及在扩增前将样品 RNA 与逆转录酶和 DNA 引物进行初始孵育。

qPCR 的工作原理

qPCR 依靠来自嵌入染料或水解探针的荧光来测量每个热循环后的 DNA 扩增。 最常见的基于染料的方法是 SYBR Green，最常见的基于探针的方法是 TaqMan。

SYBR Green qPCR

与标准 PCR 一样，SYBR Green 方案由变性、退火和延伸阶段组成。 不同之处在于，您在 qPCR 设置期间将一些双链 DNA 结合染料 SYBR Green I 添加到预混液中。 这种荧光染料在延伸阶段嵌入到双链 DNA 序列中，显示出荧光信号的强烈增加。 在每个热循环结束时测量此信号将使您能够确定存在的双链 DNA 的数量。

SYBR Green 检测的缺点是染料会与任何双链 DNA 序列结合。 这意味着您还可以检测非特异性 qPCR 产物（例如引物二聚体）发出的荧光。 为消除这种风险，通过执行熔解曲线分析检查反应特异性，或使用 TaqMan 方法。

TaqMan qPCR

该测定不使用嵌入染料，而是使用带有 5' 荧光报告染料和 3' 淬灭染料的 TaqMan 探针。 这些探针是目标特异性的，并且在退火步骤中仅与引物之一下游的目标 DNA 序列结合。 当 Taq 聚合酶在延伸阶段遇到 TaqMan 探针时，它会置换并切割 5' 报告染料。 一旦报告染料与淬灭染料分离，其在每个 qPCR 循环结束时的可测量荧光信号就会显着增加。 第二条 DNA 链是平行合成的，但由于没有探针附着在它上面，因此无法通过荧光测量来监测这一过程。

与 SYBR Green 检测相比，使用 TaqMan 探针的成本更高，但也具有两个显着优势：

• TaqMan 检测仅测量目标序列的扩增进程，因为探针是目标特异性的。

• 您可以通过向主混合物中添加不同的引物和具有不同报告染料的 TaqMan 探针来监测单个反应中各种 qPCR 产物的数量。 这种多重方法允许您在每个热循环结束时检测多个荧光信号。

图1.SYBR Green 与 TaqMan原理示意图

对于这两种 qPCR 方法，数据在扩增图中可视化，x 轴为热循环数，y 轴为检测到的荧光信号：

图2. qPCR 扩增数据图