项目文章丨单细胞测序揭示胰腺癌中T细胞和肿瘤细胞相互作用机理

2022 年 7 月，北京大学第一医院普外科杨尹默教授团队和南京医科大学第一附属医院胰腺中心在 Cancer Letters（IF: 9.756） 在线发表了应用单细胞转录组揭示胰腺癌中 T 细胞和肿瘤细胞之间的 CCL5/SDC1 受体-配体相互作用的文章。本研究中 10x 单细胞转录组测序由博奥晶典提供。

【发表期刊】Cancer Letters

【发布时间】2022年7月

【影响因子】9.756

【检测技术】scRNA-seq

研究背景

胰腺导管腺癌 （PDAC） 的肿瘤微环境（TME）复杂，由大量的基质细胞组成。其中，肿瘤浸润性T细胞在肿瘤进展中起着关键作用。PDAC 患者对免疫检查点抑制剂反应不佳，可能与免疫抑制的 TME 以及免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用有关。肿瘤浸润性 T 细胞表达的CCL5可通过多种途径促进肿瘤发展，SDC1和SDC4是CCL5的受体，然而，CCL5-SDC1/4相互作用在PDAC的作用仍不清楚。

研究思路

研究结果

1. PDAC患者样本的总体情况

对 6 名未接受任何术前治疗的 PDAC 患者的 4 个肿瘤和 4 个相邻的非癌组织进行 scRNA-seq。经过严格筛选，获得 38, 260 个细胞，鉴定出了 13 种已知的细胞类型（图1A-B）。为了揭示 PDAC 中 T 细胞异质性，分离了 T 细胞并进行了单独的聚类分析，总共鉴定出 8 种 T 细胞亚群（图1D）。小提琴图展示了不同 T 细胞亚群的 marker 基因的表达水平（图1E），气泡图显示了 FindMakers 函数生成的前 5 个 T 细胞亚群特异性基因（图1F）。

2. PDAC 中 T 细胞的发育轨迹

根据 T 细胞的细胞类型（图 2A）、衍生标本（图 2B）和选定基因的表达水平（图 2C）进行 PDAC 的 T 细胞发育轨迹的拟时序分析，分析结果展示了两条发展路径，P1：naïve T  细胞到效应记忆 T 细胞；P2：naïve T 细胞到 Tregs。图 2D 展示了细胞状态转变相关基因的热图，这些基因被分为 6 类，其中许多免疫抑制分子，如簇 1 中的TNFRSF18、IL2RA、LAYN、TNFRSF4、TIGIT 和 BATF，从初始 T 细胞到 Tregs 逐渐增加。此外，RNA 速率分析展示了从幼稚 T 细胞到效应记忆 T 细胞或 Tregs 的转录动力学（图 E）。分离 cluster 0 和 cluster 2（幼稚 T 细胞）和 cluster 1 （Tregs）以鉴定与从幼稚 T 细胞到 Tregs的细胞状态转变相关的潜在基因（图 F）。Tregs与肿瘤患者的预后和免疫治疗反应密切相关，因此，研究人员比较了不同样本中 Tregs 的比例，发现肿瘤组织中 Tregs 的比例明显高于非癌组织（图 G）。使用生物信息学工具进一步验证这一结果，即 PDAC 中 Tregs 的比例显著高于正常胰腺组织（图 H）。此外，Tregs的 marker 基因 TNFRSF4 在 PDAC 有潜在的预后价值，与 TNFRSF4 表达水平较低的患者相比，TNFRSF4 表达水平较高的患者具有更好的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）（图 I–J）。

3.  PDAC 中导管恶性细胞的鉴定及其与 T 细胞的相互作用

分离出导管细胞构建新的基因细胞矩阵，单独进行聚类分析，确定了 8 个Clusters （图3A）。Clusters 2/3/5/6 的体细胞大规模染色体拷贝数变异（CNV）水平显著高于对照细胞（T 细胞、巨噬细胞和内皮细胞），因此，将 Clusters 2/3/5/6 定义为恶性导管细胞（图 3B-C）。小提琴图显示不同导管细胞亚群肿瘤 marker 基因的表达水平，CEACAM5、TFF1 和 TFF2 在部分肿瘤簇中富集，验证了导管细胞恶性特性（图3D） 。在 TME 中，不同细胞亚群之间存在复杂的细胞间通讯，共同促进肿瘤的发展，图  3E 展示了 PDAC 中肿瘤浸润 T 细胞与恶性导管细胞之间的受体-配体相互作用，结果显示肿瘤细胞和 T 细胞之间有很强的联系，其中T细胞分泌的趋化因子 CCL5 可以与肿瘤细胞表面的受体 SDC1 和 SDC4 结合（图 3E）。

4. 基于 scRNA-seq 分析 CCL5、SDC1、SDC4 的表达和分布

为了进一步研究 CCL5 和 SDC1/4 的表达和分布，作者从开放数据库下载多个 PDAC 人和小鼠 scRNA-seq 数据集。图 4A-B 为不同数据集 PDAC 的细胞图谱。图 4C-E 展示了不同数据集的不同细胞类型中 CCL5、SDC1 和 SDC4 的表达水平，CCL5 在 T 细胞中特异表达，导管细胞较高水平表达 SDC1 和 SDC4。RNA Fish 检测结果显示 CCL5 和 CD3D 在 PDAC 和邻近的非癌组织中的共定位（图 5C）。综上所述，T 细胞可能分泌趋化因子 CCL5，与 PDAC 中的肿瘤细胞表面受体 SDC1/4 结合。

5. PDAC 中的 T 细胞表达了丰富的 CCL5

为了更好地描述 PDAC 中肿瘤浸润性 T 细胞群的特征，研究人员获取了人类和小鼠所有 scRNA-seq 数据集中 PDAC 中 T 细胞的共同标记基因（图 5A-B）。CCL5 是 T 细胞常见的标记基因之一。RNA Fish 结果显示 CCL5 和 CD3D 在 PDAC 和邻近的非癌组织中的共定位（图5C）。图 5D 显示 CCR1、SDC1、SDC4 在不同细胞系间的相对表达，可以发现包括 PANC-1 在内的许多 PDAC 细胞系，SDC1 和 SDC4 水平高于正常胰管细胞株（hTERT-HPNE）。PANC- 1 浓度梯度刺激实验结果表明，CCL5 刺激后，PANC-1 的迁移能力明显增强（图 5E-F）。接下来，作者提取了 PANC-1 和 AsPC-1 的 总  RNA，与重组 CCL5（2 ng/ml）孵育 24 小时后进行 RNA-seq。火山图显示 PBS 组和实验组之间的差异表达基因，这些差异表达基因在细胞迁移中富集（图5G-H）。

6. CCL5 通过与 SDC1 相互作用促进肿瘤细胞迁移

接下来，研究人员进一步检测了 CCL5 在肿瘤细胞迁移中的作用，通过不同浓度梯度的重组人  CCL5（2-4 ng/ml）处理后的 PANC-1 和 AsPC-1 与对照组相比，细胞迁移能力显著提高（图6A-D）。为了验证 T 细胞可能通过体外 CCL5 和 SDC1 的受体-配体相互作用与肿瘤细胞作用的假设，作者通过慢病毒载体将 SDC1 的 shRNA 转入 PANC-1。RT-qPCT 和 Western blot 结果显示，转染后，PANC-1 中 SDC1 在转录本水平以及蛋白水平均显著下调（图6E）。SDC1 的敲除部分降低了 CCL5 促进肿瘤细胞迁移的能力（图6G-H）。综上所述，肿瘤浸润的 T 细胞可能通过 CCL5/SDC1 促进肿瘤细胞迁移。

总结

1. 绘制了 PDAC 的完整细胞图谱，推断了 T 细胞的发育轨迹，并鉴定出恶性导管细胞；

2. 发现 PDAC 中肿瘤浸润 T 细胞富集了 CCL5 的表达；

3. 利用 iTALK 方法观察到 T 细胞和肿瘤细胞之间的 CCL5-SDC1/4 受体-配体相互作用；

4. 体外证明了 T 细胞可以通过 CCL5/SDC1 轴促进肿瘤细胞迁移，靶向 CCL5/SDC1 轴可能是一种有效的 PDAC 治疗方法。

参考文献

Chen K, Wang Y, Hou Y, Wang Q, Long D, Liu X, Tian X, Yang Y. Single cell RNA-seq reveals the CCL5/SDC1 receptor-ligand interaction between T cells and tumor cells in pancreatic cancer. Cancer Lett. 2022 Oct 1;545:215834. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215834.

博奥晶典科研服务事业部 李心馨 丨文案

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