质粒扩增protocol，你值得拥有

质粒扩增是分子实验室的基本技能，但对于刚进实验室的小伙伴来说还是会手忙脚乱。今天小编就此整理了质粒扩增的常规步骤供大家参考。

实验试剂及仪器

DH5α感受态细胞，LB液体及固体培养基，抗生素；移液枪，离心管，无菌培养皿，恒温水浴锅，离心机，超净工作台

操作步骤

1.  从-80℃冰箱中取出100 μl感受态细胞置于冰上融化；

2.  快速加入2 μl质粒溶液，即大约1μg质粒，轻轻摇匀；

3.  冰浴30min，同时将水浴锅预热至42℃；

4.  置于42℃水浴锅中热激45-90s（一般90s），热激过程中不要移动离心管；

5.  马上冰浴3-5min；

6. 向离心管中加入1ml 无抗性LB液体培养基，吹打混匀后于37℃摇床200rpm/min，振荡培养1 h，可见轻度浑浊；细菌恢复正常生长状态，并表达质粒中的抗生素抗性基因；

7.  接着5000-6000 rpm/min离心5 min；

8.  弃上清900μl，留100 μl液体重悬细菌；

9.  提前准备好带相应抗生素的固体培养基，在37℃孵箱预热；

10.  将100μl重悬细菌接种至含抗生素的固体培养基上，用接种环涂布均匀；

11.  接种后。正面向上防止30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37℃孵箱培养12-16 h；

12.  挑克隆，用枪头将克隆菌挑出，接种到5ml含相应抗生素的LB液体培养基中；

13.  37℃摇床200rpm/min，培养12-16 h，可见菌液浑浊；

14.  离心收集后，使用去内毒素的质粒提取试剂盒进行质粒提取。

注意事项

1、  一般来说质粒DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；

2、  整个操作过程需在无菌条件下进行；

3、  热激时间不宜过长或过短，动作轻柔；

4、  抗生素的工作浓度参考试剂附带的说明书，一般Amp+或Kan+的工作浓度约为50μg/ml。

5、  如果提取质粒后续需要转染细胞，质粒提取试剂盒务必选择去内毒素的。