SCIENCE ADVANCES | 基于类器官的CRISPR-Cas9筛选肠上皮成熟和细胞命运的调节因子

器官发育过程中，及时调节组织成熟对于平衡生长与分化细胞类型的出现和组织功能的获得至关重要。发育中的肠管最初从假复层上皮转变为由初级绒毛和绒毛间结构域组成的简单上皮。绒毛间结构域随后引起上皮内陷，随后形成成年隐窝，即成年肠道干细胞的小窝。这些形态重排控制着成年肠道干细胞的出现，作为等能的胎儿祖细胞受到来自新兴干细胞生态位的指导性提示。尽管许多研究已经涉及肠道发育过程中的形态学事件和成年肠道干细胞行为的调节，但对从胎儿细胞状态过渡到成年细胞状态相关的转录调节知之甚少。因此作者采用CRISPR-Cas9技术和定制设计的小引导RNA（sgRNA）文库靶向转录调控中的功能域，以此识别组织成熟的调节因子，进一步证明了类器官技术的新应用。

2023年7月，由Stine L. Hansen为第一作者在《SCIENCE ADVANCES》杂志发表题为《An organoid-based CRISPR-Cas9 screen for regulators of intestinal epithelial maturation and cell fate》的文章，该文章首次利用CRISPR-Cas9技术筛选出基因Smarca4和Smarcc1。确定了编码SWI/SNF复合物成分的基因Smarca4和Smarcc1是上皮成熟的障碍。SMARCC1作为一种与SMARCA4协同作用的新因子的鉴定突出了SWI/SNF复合物在维持肠祖细胞状态中的作用。这种保护作用通过使细胞命运决定向自我更新分裂倾斜，从而支持胎儿发育过程中上皮的持续生长。

首先，作者采用单细胞测序技术测定胎儿和成人小肠上皮的类器官培养物的细胞组成。结果表明，体内肠上皮中存在的所有主要细胞类型都可以在aOrgs中鉴定。在胎儿肠球（FEnS）中鉴定了两个细胞群，它们与祖细胞具有不同的转录谱，与成年分泌谱系聚集在一起。这些细胞分别与成年上皮中的杯状细胞和簇状细胞具有显著的转录相似性，并且被称为成人样胎儿簇I和II。FEnS中存在少量成体样分泌细胞，并且培养物没有自发转化为aOrgs，这表明转录或表观遗传学障碍阻止了向成熟成体状态的完全转变。因此，推断功能性CRISPR-Cas9筛选可以识别转录调节因子，这些转录调节因子构成了从胎儿状态向成人状态过渡的屏障。为了鉴定区分FEnS和aOrgs的细胞表面标记物，作为其成熟状态的功能读数，作者利用了scRNA-seq数据集。结果显示：过滤细胞表面相关基因的DEGs列表将Ly6a（SCA1）和Kit（cKIT/CD117）鉴定为胎儿祖细胞和分泌细胞的标记。SCA1先前已被描述为胎儿肠道状态的标志物和在组织损伤期间经历短暂胎儿样重编程的成人肠道细胞的标志物。类似地，CD117是成人小肠和结肠中分泌细胞的众所周知的标志物。对两种标记物表达的分析进一步支持了这些观察结果，并证明了SCA1在FEnS中的特异性表达。CD117和SCA1的组合因此在aOrgs和FEnS之间提供了与它们的成熟状态一致的高辨别能力（图1）。

为了进行CRISPR-Cas9的筛选，作者在FEnS中表达组成型活性Cas9，并用sgRNA文库在多重感染（MOI）=0.3和每个sgRNA>400倍的覆盖率下转导这些。在时间点T=0收集sgRNA库的基线参考样品。随后将转导的细胞传代三次，在每次传代时，对2/3的培养细胞进行分选，以分离SCA11HighCD117Neg胎儿祖细胞、SCA1LowCD117Pos分泌细胞和SCA1LowCD117Neg细胞，这些细胞被认为从胎儿状态向成人样状态过渡。在每个时间点，我们鉴定了SCA1LowCD117Pos分泌细胞和SCA1LowCD117Neg细胞的过渡细胞。对来自每个分离的细胞群的DNA进行靶向测序，以量化相对于参考T=0样本的三个时间点上单个sgRNA的丰度。正如预期的那样，靶向与原代细胞功能相关的必需基因的sgRNA在T=1时已经迅速耗尽，而扰乱的对照sgRNA在三个传代过程中保持稳定（图2）。

为了对CRISPR-Cas9介导的单个基因破坏的影响进行有力而严格的分析，我们利用我们的每个基因多sgRNA方法的力量来量化针对同一基因的单个sgRNA的联合效应。结果表明：SCA1表达的丧失和产生CD117Pos细胞的能力的增加，Smarca4或Smarcc1受损的胎儿祖细胞失去了其胎儿特征并获得了成人样表型。这表明SMARCA4和SMARCC1可以通过充当成熟的表观遗传学屏障，在保护胎儿祖细胞状态方面发挥作用（图3）。

作者通过研究Smarca4mut和Smarcc1mut品系与加扰对照相比是否具有增强的成熟能力。将类器官移植到成年小鼠的结肠上皮中已被用于确定胎儿和成年肠道中类器官的分化潜力，通过成人小肠和结肠的类器官进行的移植实验以及对移植材料进行染色，结果显示SMARCA4和SMARCC1对保护胎儿状态很重要，并且SMARCA4或SMARCC1通常会在胎儿细胞成熟过程中形成表观遗传学屏障（图4）。

为了了解通过破坏Smarca4和Smarcc1而产生的细胞状态的分子特征，作者对突变系和扰乱的对照进行了大量RNA-seq。发现Smarca4或Smarcc1破坏后下调的基因主要在FEnS中表达。相反，Smarca4和Smarcc1破坏后上调的基因在分泌细胞、肠细胞和干细胞谱系的成体细胞中表达。这进一步支持了SMARCA4和SMARCC1在维持胎儿未成熟细胞成熟的表观遗传学屏障方面的功能。

为了了解Smarca4或Smarcc1如何促进成人样成熟，作者使用与胎儿和成人状态相关的许多转录特征进行了基因集富集分析（GSEA）。结果表明，Smarca4mut和Smarcc1mut系表现出与其胎儿样起源不同的转录和表观遗传学特征，向成人样状态转变，这与YAP1依赖性转录程序的活性降低和产生簇状细胞的倾向增强进一步强调了SMARCA4和SMARCC1在保护胎儿状态中的作用。Smarca4mut和Smarcc1mut系表现出与其胎儿样起源不同的转录和表观遗传学特征，向成人样状态转变，这与YAP1依赖性转录程序的活性降低和产生簇状细胞的倾向增强有关，进一步强调了SMARCA4和SMARCC1在保护胎儿状态中的作用（图5）。

为了解决在单细胞水平上突变Smarca4和Smarcc1后在体外产生的成体样细胞类型，作者对扰乱的对照、Smarca4mut和Smarcc1mut以及aOrgs进行了scRNA-seq。与扰乱对照相比，观察到整个胎儿转录调控信号的表达显著降低。分析转录相似性进一步表明，衍生自突变系的簇状细胞在转录上与成体细胞相似，表明这些细胞已转变为成体样状态。总之，这些结果表明，Smarca4和/或Smarcc1的突变使胎儿肠道祖细胞的体外培养失去了其固有的未成熟特性，促进了分化为具有簇状细胞特性的成人样状态的细胞比例的增加（图6）。

作者已经成功地在肠道类器官中实现了CRISPR-Cas9筛选，靶向来自不同组织成熟阶段的上皮培养物中差异表达的转录和表观遗传学调节因子。这是第一个使用未成熟胎儿样类器官进行体外CRISPR-Cas9筛选的例子，以揭示组织成熟的调节因子，突出了类器官技术的多功能性。通过对胎儿和aOrgs的单细胞分析，观察到在稳态条件下，少数胎儿细胞向分泌谱系的成体样细胞过渡。确定了编码SWI/SNF复合物成分的基因Smarca4和Smarcc1是上皮成熟的障碍，因为这些基因在体外的破坏促进了胎儿样标记物的丢失和分泌前体和簇状细胞标记物的获得，以及类似aOrgs的转录和表观遗传状态的采用。体内移植研究进一步表明，与混乱的对照系相比，Smarca4mut和Smarcc1mut系具有更强的小肠特性。正如先前的遗传学研究报道的那样，Smarca4参与肠道成熟，作者的筛选成功地建立在这些观察结果的基础上，并报道了Smarca在保护细胞身份方面尚未被重视的作用。SMARCC1作为一种与SMARCA4协同作用的新因子的鉴定突出了SWI/SNF复合物在维持肠祖细胞状态中的作用。这种保护作用通过使细胞命运决定向自我更新分裂倾斜，从而支持胎儿发育过程中上皮的持续生长。