蛋白质热位移测定法的使用应用生物糸统公司的实时PCR
摘要
蛋白质热位移™（PTS）分析是一种优秀的高通量筛选方法，它使研究人员能够快速监测蛋白质的热稳定性，并确定有利于蛋白质稳定性的最佳条件，包括蛋白质-配体相互作用和蛋白质序列突变的研究。蛋白质热位移是基于温度诱导的蛋白质变性，使用应用生物系统公司的蛋白质热位移™染料进行监测。这种检测方法不需要任何关于蛋白质功能或配体活性的先验知识。应用生物系统公司的实时PCR系统绘制整个热熔体中的荧光数据，在测试缓冲环境中或在测试配体存在的情况下生成感兴趣蛋白质的荧光谱。因此，我们开发了蛋白质热位移™软件v1.0，该软件利用玻尔兹曼方程从荧光熔体图中计算出蛋白质的Tm。然后，可以比较使用一系列缓冲条件、添加不同配体或改变蛋白质折叠和稳定性的蛋白质序列突变所获得的Tm值。在这项研究中，我们演示了这个分析的效用缓冲和配体筛选T4 DNA连接酶，其Tm转移ATP的存在，使蛋白质热转移™分析一个重要的新筛选工具™射线晶体学家寻找条件，促进他们感兴趣的蛋白质的稳定性。此外，我们还证明了该PTS检测在区分M-MLV、上标®II和上标®III逆转录酶的点突变变异方面的实用性。最后，我们证明了该PTS可以有效地检测抗体与目标蛋白的结合。
介绍
分离或获取感兴趣的蛋白质往往涉及到困难和费用，需要注意后续处理或存储，以最大限度地提高蛋白质的效用和寿命，并确保数据质量不受降解或聚合事件的影响。有利于长期稳定性的条件是几乎所有涉及蛋白质的研究或应用技术的共同要求。有许多因素可能影响蛋白质的稳定性，包括盐浓度、pH或使用特定的配体，可以以不同的方式与蛋白质相互作用。考虑到人们可以测试大量可能的组合，以确定有利于最大稳定性的环境条件，因此非常希望采用一种能够简化和简化调查过程的技术。AB®实时PCR系统上的PTS检测是一种快速、方便的检测蛋白质热稳定性变化的筛选方法。
材料和方法
应用生物系统公司的蛋白质热转移™染料的使用减轻了任何对蛋白质功能或配体活性的先验知识的要求。在天然蛋白质的存在的情况下，染料被自然猝灭。当感兴趣的蛋白质随着温度的升高而开始变性时，蛋白质的疏水核心就会暴露出来。染料会对环境中的这种变化做出反应，并开始发出荧光
图1。PTS染料的预测作用示意图。自然淬灭的染料只有在暴露在变性蛋白质的疏水区域时才会发出荧光。
结果
应用程序的蛋白质热轮班™ :筛选蛋白质稳定性的优化缓冲条件筛选能够结合和增强蛋白质稳定性的配体通过点突变进行筛选以增强稳定性筛选能提高蛋白质结晶稳定性的条件。
图2。在Viia上生成的熔化曲线数据 7实时PCR系统显示特异性配体（ATP）对蛋白质稳定性（T4DNA连接酶）的影响。T曲线的增加超过7oC在有配m体存在的情况下。图2描述了一种特定的蛋白质配体TSA的四次重复反应。左图为熔体曲线，右图为熔体曲线的导数。红色曲线代表T4 DNA连接酶没有配体时，蓝色曲线代表ATP存在时的T4 DNA连接酶，绿色曲线为对照。T4 DNA连接酶的Tm约为41℃当ATP加入到反应中时，它会发生偏移，导致偏移约为7oC更高。这种转变清楚地证明了添加ATP所增加的稳定性。
应用生物系统的蛋白质热Shift™软件 v1.0提供通过玻尔兹曼曲线拟合和导数峰计算的蛋白质Tm针对参考曲线的增量Tm值(s)打印、表格和导出结果多板分析与重复统计数据快速Delta Tm可视化
缓冲区试验面板(A1-D4):
A（100 mM柠檬酸钠，pH 5.5,0-150 mM氯化钠）
B (100 mM磷酸钾，pH值6.0,0150 mM氯化钠）
C (100 mM磷酸钾，pH值7.0,0150 mM氯化钠）
D（100 mM Hepes，pH 7.5,0-150 mM氯化钠）
图4。通过在7500快速实时荧光定量PCR仪上进行的
PTS实验，研究了盐浓度和pH对T4 DNA连接酶稳定性的影响的衍生熔融曲线（非专家模式）。整个图中的
Tm差异范围为39.5 C（A3）至45 C（C4），证明了缓冲条件对蛋白质热稳定性的影响。在储存或处理缓冲液中的盐与蛋白质的带电氨基酸相互作用，最终影响所产生的蛋白质三级结构的稳定性。
图5。PTS分析可以区分影响蛋白质热稳定性的蛋白质中的点突变。PTS在ViiA上生成的数据TM7仪器显示了来自实验MMLV、上标®II和上标®III（上）的荧光和衍生物熔体谱，以及每个酶通过与配体孵育而热移（下）
图6。单克隆抗体（抗人装饰蛋白）与人装饰蛋白结合得到的PTS含量小于10 C，证明了抗体能有效地检测到抗体与该蛋白的结合。本PTS实验在7500快速实时PCR仪上（非专家模式）上进行。
结论
蛋白质热转移™是一种快速、廉价和直接的工具，用于筛选最合适的条件，最大限度地提高蛋白质的稳定性。AB实时PCR仪器的使用提供了一系列的好处，以帮助蛋白质热位移™测试工作流程。此外，操作软件的灵活性允许在任何期望的斜坡速度下在广泛的温度范围内收集荧光数据，数据很容易在系统软件中查看，或导出以供离线进一步分析。这些数据来自应用生物系统的实时PCR系统，包括7500,7500快速，StepOneTM，StepOnePlus和tmViia 7个实时PCR仪器，展示了这些系统的多功能性。使用AB实时PCR系统和蛋白质热移进行蛋白质热移分析的tm好处软件v1.0包括自动生成的汤姆，增加运行方法程序的灵活性和用户的能力重置温度范围在更复杂的融化的情况下，在小反应体积，提供快速和准确的结果只有几µg的蛋白质。
参考文献
1.Neisen等。al.-2007年9月13日在线发布；doi：10。
1038/ nprot.2007.321
2马拉夫斯基等。al蛋白质科学。2006 15: 2712-2718
仅供研究使用。不打算用于任何动物或人类的治疗或诊断用途。
