1个月接收！“三级淋巴结构（TLS）”这个热点勿错过~ Nature综述提供基因集，疾病分型
三级淋巴结构（TLS）是什么？
TLS与预后和免疫治疗有何关系？
TLS做生信分析有现成的基因集合吗？
番茄君这就给你一一解答：
1. 基本概念：三级淋巴组织(TLSs)是在包括肿瘤在内的长期炎症部位形成的异位淋巴组织。TLSs在结构上类似于次级淋巴器官(SLOs)，主要由B细胞、T细胞、树突状细胞(DC)、中性粒细胞和巨噬细胞组成。TLSs还包括高内皮小静脉和淋巴管，有助于引导免疫细胞转运到TME。
2. TLS与预后和免疫治疗有何关系？
在某些实体肿瘤中，TLSs是预后和免疫治疗反应的潜在预测因子。TLSs在大多数实体肿瘤中与更好预后相关，可以预测ICB治疗反应。基于此，诱导TLSs被认为是恶性肿瘤的一种潜在治疗策略。
3. 那TLSs能做生信分析思路嘛？如果能，有现成的基因集吗？
（没有思路、不知道怎么创新的找番茄君，超多个性化的分析思路供你选择！）
有一篇Nature综述提供了TLS相关的基因集合：
39个TLSs特征基因包括：CCL2/3/4/5/8/18/19/21、CXCL9/10/11/13为趋化因子标记基因；CXCL13、CD200、FBLN7、ICOS、SGPP2、SH2D1A、TIGIT、PDCD1为T滤泡辅助细胞(Tfh细胞)的特征基因；CD4、CCR5、CXCR3、CSF2、IGSF6、IL2RA、CD38、CD40、CD5、MS4A1、SDC1、GFI1、IL1R1、IL1R2、IL10、CCL20、IRF4、TRAF6、STAT5A为TH1细胞和B细胞标记基因；TNFRSF17是浆细胞标记基因。
既然已经有现成的基因集合了，那么就可以直接拿来做生信分析啦！
接下来番茄君给大家分享一个疾病分型+二次聚类+TLS评分的纯生信分析思路~
题目：三级淋巴结构模式有助于膀胱癌肿瘤微环境浸润的识别和治疗药物的选择
杂志：Frontiers in immunology
影响因子：8.786
发表时间：2022年11月
研究思路
从TCGA、GEO、ArratyExpress和IMvigor210下载18个膀胱癌(BCa)数据集。基于39个TLS特征基因(TSGs)评估所有患者的TLS模式，并将TLS模式与预后和肿瘤微环境(TME)细胞浸润特征进行了相关性分析。使用cox回归模型和主成分分析(PCA)算法构建TLS评分，分析TLS评分预测预后、免疫治疗和化疗反应的作用。
主要结果
1. BCa中TLS特征基因(TSGs)分析
分析BCa中39个TSGs的体细胞突变和拷贝数变异(CNV)的发生率。发现这些基因在BCa中的突变率较低，而所有TSGs中CNV均有改变。然后使用Combat算法消除18个数据集的批效应，并将其合并为一个新的队列。在处理前，这些数据集可以很容易地通过主成分分析(PCA)进行区分(图D)，而处理后的数据集融合良好(图E)。
图1. BCa中TLS特征基因的遗传变异及18个数据集的组合
2. 聚类分析TLS模式和肿瘤微环境（TME）细胞浸润特征
采用非负矩阵分解(NMF)算法进行聚类，分为5个TLS模式，称为TLS亚群C1-C5。分析五种TLS模式的免疫细胞浸润是否存在显著差异，进行了TME浸润分析。TME细胞浸润特征与生存分析结果一致，C1和C2组患者与其他组相比具有明显的生存优势。进一步分析了5个TLS模式中的TSGs特征，发现5个亚群中25个TSGs转录谱的显著差异。
图2. 聚类分析和免疫细胞浸润分析
3. 基于5个TLS亚群间的差异表达基因（DEGs）进行二次聚类
Limma分析出77个与TLS亚群相关的DEGs。Cox回归模型筛选出33个有预后价值的DEGs，对DEGs进行GO和KEGG富集分析，这些DEGs在免疫细胞活化、细胞因子受体反应和T细胞信号通路高度富集，再次证明TLSs在TME的调节中起重要作用。然后，采用无监督聚类算法对这33个TLS相关DEGs进行聚类分析，将患者分为4个基因组亚组，命名为基因Cluster A-D。
同样，分析了这四个基因Cluster在TME细胞浸润方面的差异，发现与TLS模式相似的浸润特征。生存分析显示，基因Cluster A的患者比基因Cluster B-D的患者预后好。然后分析了这五个基因Cluster中TSGs的表达水平。
图3. TLS基因的二次聚类、免疫浸润和预后分析
4. 构建TLS评分
构建一个评分系统（TLS评分）来量化TLS模式，并根据该评分将患者分为TLS高评分组和TLS低评分组。使用基因集富集分析(GSEA)来研究TLS高评分组和TLS低评分组之间的差异活性通路。结果发现低TLS评分组主要富集于免疫应答相关通路，而高TLS评分组代谢相关通路和细胞生长分化相关通路富集。在元队列和IMvigor210免疫治疗队列中，TLS评分低的患者具有显著的生存优势。TLS评分与TMB之间没有显著的相关性，结合TLS评分和TMB来预测预后，发现高TMB和低TLS评分的患者总生存期最好，低TMB和高TLS评分的患者总生存期最差。
5. TLS评分和TME细胞浸润
使用TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT- abs、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、XCELL和EPIC等9种算法对两个TLS评分组的TME免疫细胞浸润特征进行分析。发现TLS评分低组免疫评分和ESTIMATE评分较高。ssGSEA显示了两组免疫功能的差异，发现低评分组在除IFN-γ反应外的几乎所有抗肿瘤过程中免疫功能都更好。
图5. TLS评分高组和低组TME细胞浸润特征
分析TLS评分与免疫细胞浸润水平的相关性，发现TLS评分与大多数免疫细胞浸润水平呈显著负相关。
图6. TLS评分与免疫细胞的线性回归分析
6. TLS评分在免疫治疗和化疗中的作用
上述结果表明，TLS评分是预测预后的良好指标，且与免疫细胞浸润水平密切相关。推测TLS评分低可能代表对免疫治疗更敏感的免疫亚型。因此，分析TLS评分与ICB治疗反应之间的相关性，发现较低的TLS评分与抗PD-1免疫治疗的更好反应显著相关。
然后，根据抗PD-L1和抗CTLA-4治疗的使用情况，将患者分为四个亚组:CTLA-4阳性PD-1阳性、CTLA-4阳性PD-1阴性、CTLA-4阴性PD-1阳性、CTLA-4阴性PD-1阴性。在四个亚组中，低TLS评分组的IPS评分均显著高于低TLS评分组，这表明低TLS评分组的患者与高TLS评分组相比，抗PD -1、抗CTLA -4或联合免疫治疗的反应更好。
肿瘤免疫功能障碍和排除(Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE)分析发现低TLS评分与高TIDE评分相关，这种免疫逃避效应可能是由于低TLS评分组Treg浸润水平较高所致。
此外，还分析了TLS评分与化疗反应之间的关系，发现TLS评分低与吉西他滨、顺铂、长春碱、表柔比星敏感性评分低显著相关，提示TLS评分低组对化疗的敏感性较高。
图7. TLS模式在免疫治疗和化疗中的作用
总结
这篇文章就是以TLSs为切入点进行分析，进行疾病分型，先根据TLS特征基因进行聚类，再根据5个TLS亚组间的DEGs进行二次聚类。最后构建了TLS评分，分析思路并不复杂，就因为分析了TLSs使得纯生信文章1个月就接收！轻松拿下8分+，性价比高得让人心动~
目前，利用TLS相关基因做生信分析的文章还比较少，选对生信切入点，轻松发文不是梦~感兴趣的小伙伴赶快行动起来吧！想定制创新性思路欢迎直接call番茄君哦，下一篇生信文章在向你招手！
