基因表达调控开关必备工具—Tet诱导表达系统

基因的表达调控是研究基因功能和相关分子机制中最为常用的方法，也是生物医学科研领域最基本的内容。随着研究的深入，人们对于目的基因的表达调控也有不同的需求，例如需要调控目的基因在特定时间表达或下调，以观察在某一状态或某一时间段内基因表达变化对细胞或机体生长状态或表型的影响。Gossen及其同事在1992年和1995年的两项开创性工作中为控制基因表达带来了福音，他们成功引入了基因开关来控制真核生物中的基因表达[1, 2]。即目前广泛应用于基础研究和基因治疗的tet-on和tet-off基因表达系统，下面就来具体了解下这两种基因表达系统吧。

       Tet其实是四环素的英文Tetracycline简写过来的，因此tet-on和tet-off是指由四环素控制的基因表达系统。“on”有“开”的意思，tet-on系统是在使用四环素或其衍生物后即可激活基因的表达；相反，“off”是“关”，tet-off系统则是通过使用四环素来沉默基因表达。

       这种Tet控制的基因表达系统源自于大肠杆菌转座子Tn10 tet抗性操纵子。Tet对于革兰氏阴性菌是一种强效抗生素，为抵御Tet的杀伤作用，细菌通过进化表达一种定位于细胞膜上的TetA抗性蛋白来实现对Tet的抗性。其妙处在于TetA是由Tet条件性诱导表达的。通常情况下（没有Tet的情况下），TetA不会表达，因四环素阻遏物（TetR）二聚体在TetA启动子区与操纵子序列TetO结合，从物理上阻碍了TetA启动子的转录起始，进而抑制其的表达。当细胞内Tet浓度升高时，Tet与TetR结合形成复合物，TetR构象发生变化而无法结合TetO，使TetA得以起始转录表达，而胞内Tet浓度下降时，TetA表达随之逐渐被抑制。这种TetR与TetO的结合使得基因可通过条件性诱导其表达，并且调控是可逆的，为转化应用到真核生物中条件性调控基因表达提供了基础。

  由此可见，tet调控系统应用到的主要元件是TetR与TetO。

Tet系统的结构与原理[3]

       Tet-off系统：1992年由Gossen等人针对TetR与TetO元件率先开发的、应用于哺乳动物的基因表达调控系统。Tet-off系统包含两个部分结构，第一部分是将TetR与单纯疱疹病毒VP16的转录激活结构域融合，得到可由Tet控制的转录激活因子（tTA）；第二部分是Tet反应启动子（Ptet），这是将TetO序列融合到缺乏增强子序列的最小启动子CMV前面。当没有给与Tet的情况下，tTA与Ptet结合，在转录激活结构域的作用下激活下游基因的表达；当施加Tet或其衍生物后，tTA与Tet结合而构象改变，无法与Ptet结合，使得缺乏增强子的CMV启动子不足以支持转录起始，进而“关闭”基因表达。

       Tet-on系统：如果只需要在某一时间段表达目的基因，那么对于tet-off系统在该时间段以外就需要持续使用诱导剂处理，显然是不方便的。于是Gossen带领团队在1995年开发了tet-on系统来解决这一问题，该系统与tet-off相反，它需要添加诱导剂来激活基因表达。实现tet-on系统与tet-off系统的不同点在于对TetR做了突变，产生出一个作用相反的TetR，因此与VP16融合后称为rtTA。第二个结构Ptet启动子不变。tet-on系统在没有Tet相关诱导剂的时候，rtTA基本不与Ptet结合，下游基因表达受抑制；在给与诱导剂后，rtTA与Tet结合使其与Ptet结合，进而激活下游基因表达。但tet-on系统存在较高的表达泄露风险，后来开发了M2rtTA2代替rtTA，可以降低表达泄露的风险，之后再进一步对M2rtTA2设计5个氨基酸突变，表达的蛋白命名为Tet-on 3G蛋白（TRE3G），可优化与四环素相应元件的结合，以进一步提高对诱导剂的敏感性和降低表达泄露风险。

       诱导剂则是Tet及其衍生物，Tet和一些衍生物（如多西环素，Dox）已经广泛用于人类和动物的临床应用中，并且都有详细的药理学和药代动力学的研究，证明使用是安全的。因此，Tet基因表达调控系统不仅可用于基础研究，也可应用于临床基因治疗当中。但实际应用当中，Tet对tTA和rtTA的亲和力远不如Dox，Dox仅需较低浓度即可激活tet-on和tet-off系统。

       总言之，Tet系统是目前使用最广泛的药物诱导转基因表达系统之一，能够满足科研工作者在时间上控制基因表达的需求，可模拟细胞或机体生长发育不同阶段目的基因的表达变化，进而研究其中的功能和规律。汉恒生物可提供基于慢病毒载体和腺病毒载体的tet-on表达系统，欢迎联系了解咨询~

参考文献

[1]. Gossen, M. and H. Bujard. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89(12): 5547-51.

[2]. Gossen, M., S. Freundlieb, G. Bender, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science, 1995, 268(5218): 1766-9.

[3]. Das, A.T., L. Tenenbaum, and B. Berkhout. Tet-On Systems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther, 2016, 16(3): 156-67.