CRISPR/Cas9技术简述

简单来讲，CRISPR/Cas9是一种分子生物学技术，通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑。所谓的基因编辑就是通过某种生物手段和技术，对生物体内的遗传物质进行修改。

基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR/Cas9技术只包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgRNA（single guide RNA）。当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时，Cas9蛋白通过与sgRNA结合，靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生断裂后，引发细胞内部的DNA修复机制（DNA repair）。真核细胞同时存在着同源重组修复和非同源重组修复。在同源重组修复下，断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行DNA修复，而在非同源重组修复下，断裂出的DNA随机修复，引入新的碱基，使基因产生移码突变。

CRISPR/Cas9技术原理

CRISPR/Cas9的基因敲除

CRISPR/Cas9其中一种最为重要且广泛的应用便是基因敲除。

从很久以前，生物学家们就热衷于一种研究策略，那就是功能缺失策略（loss of function）。常规的理解是这样的，当我们想要去研究某个基因在整个基因组中的作用时，只需要通过某种方法将这个基因从基因组中剔除，然后观察去除这个基因之后，这个细胞或生物体会发生怎样的变化，然后根据这些变化去推断这个基因的功能。基因敲除就是用来描述将某个或某些基因从基因组中剔除这件事，而基因敲除技术则是用于完成这件事的方法或技术。

那又该如何实现基因敲除呢？

在实际实验过程中，我们只需要将Cas9蛋白和设计好的gRNA同时“运送”进细胞中即可，接下来的就交给细胞自己去操作了。

对于转导gRNA和Cas蛋白的常见方法主要有四种：

(1）RNP法：直接将大量的gRNA和Cas9蛋白，通过电转的方式转染目的细胞

(2）病毒法：构建慢病毒（LV）敲除质粒，经病毒包装和纯化后转染细胞，将sgRNA和Cas9蛋白元件整合到细胞基因组中，从而使细胞源源不断地生产sgRNA和Cas9蛋白。

(3）常规质粒法：构建常规敲除质粒，通过电转将其导入细胞，短时间内表达gRNA和Cas9蛋白。

(4）VIRUS-Free™转座子法：将携带有转座子和转座酶的质粒共转染细胞，转座酶促进转座，将高拷贝的Cas9蛋白和gRNA表达元件随机整合到基因组，实现gRNA和Cas9蛋白的持续表达。

4种基因敲除的技术对比

总的来说，蛋白法不需要构建载体，最快捷，但是sgRNA容易降解，操作难度大，一般更多应用于点突变和定点插入；常规瞬转质粒法构建简单，但是效率低；病毒法效率高，但是周期长，成本更高；Virus-Free稳转质粒法稳定整合而不需要包病毒，效率高周期短，是一种很好的替代病毒的方法。

以上内容由海星生物提供 

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