记笔记自用2

一个实验是：蛋白的免疫荧光显影

一个实验是：细胞96孔板加药

一个教程：设计引物软件使用

一个实验：挑单克隆养菌

一个简易教程：纯蛋白大致步骤

洗一抗（千分之一tween＋TBST）

mTOL通路：促合成 促进细胞增殖 抑制细胞凋亡

AmPK通路：促分解 促进细胞自噬，抑制细胞增殖

细胞状态不好时，AmPK会被激活，被激活的方式是磷酸化，此时抑制mTOL

加某种糖AmPK会被激活，细胞增殖会被抑制，目的想知道加糖之后是否有非AmPK抑制途径

GAPDH：内参蛋白（还有很多内参蛋白，之所以能成为内参蛋白，是因为蛋白量无论什么条件 几乎不会改变 因为是骨架蛋白）

细胞稀释 T25 25cm2 96孔板100 μL 荧光 三组平行实验 加糖 加抑制剂 + ++ 不加

千分之一tween＋TBST

蛋白的免疫荧光显影原理

二抗 anti-rabbit IJJ HRP linked 1μL（也是用TBST稀释1：5000）1h 室温

1.DMEM(+++) 500mL+血清+双抗

2.血清FBS Fetal Bovinr Serum灭活：4℃化冻2-3天至完全化开→58℃水浴35min→冷却至室温→放4℃→不用的分装50mL稍多一些 封口膜 冻-30℃

3.双抗Penicillin Streptomycin 100× 加5mL

96孔板取出平衡到室温30min-1h→加100 μL Kate？混合液到96孔板，微孔板恒温震荡仪shaker摇2min→暗处避光反应10min→酶标仪测定

管放盒子里 121℃ 20min 高压灭菌锅中

培养基中要加药或者别的东西都需要用滤器过滤膜除细菌

培养基 990mL+10 mL A糖

培养基 990mL+10 mL B抑制剂

培养基 990mL+10 mL A糖+10 mL B抑制剂

shake

吸走原先培养基（套小枪头贴壁吸）

加入100 μL新培养基（贴壁加）

1.回收二抗（没有沉淀可以继续用）下次用可以补1 μL 二抗

2.用TBST 洗3次，每次10min（要比一抗洗久一点）

剪角 放入5%牛奶 室温封闭1h

1.准备显影AB液 HRP Substrate，1:1混合 各0.5mL，取完放回4℃

2.仪器：Tanon 化学发光分析系统

3.将显影液（一定要均匀）铺开

4.膜正面朝上，放之前要将膜正反都在显影液上多涮几次 推进去

5.点发光拍摄→长曝光→Scheme1→拍摄→保存

6.点merge发光合成，可以显示marker

7.内参蛋白 GAPDH

→用小枪头挑一个小点，把枪头打进培养基，37℃晃一晚上

→LB培养基配方：

1. Tryptone：10g

2.Yeast Extract：5g

3.NaCl：10g

4.Agar琼脂粉：15g(固体培养基)

5.去离子水补至1000 mL

6.灭菌：盖子拧松，121℃ 20min 高压灭菌锅，打开灭菌锅的一刹那把盖子拧紧

1.板子上的菌挑出

2.50 mL摇过夜

3.全部倒入1L培养基 摇3h OD值0.6-0.8

4.加诱导剂ITTJ 500μL（一般配1 M按2000×用）

5.温度时间取决于蛋白性质