【科普】基因编辑中的CRISPR是什么-中字

Q1：CRISPR-Cas系统是什么？

A1：官方：CRISPR/Cas系统是由规律成簇间隔短回文重复序列（Clusterd regularly interspaced short palindromic repeat ,CRISPR）及CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein ,CAS protein）构成，该系统作为原核生物获得性的“免疫系统”，在细菌和古细菌抵抗外来遗传物质的过程中发挥着重要作用。

A2：说人话：CRISPR-Cas系统是一种细菌特有的免疫系统。

 

 

 

Q2：CRISPR和Cas代表什么意思？

CRISPR/cas结构示意图：

CRISPR

全称：Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats

中文：规律间隔成簇短回文重复序列

如上图，CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列（repeats）与长度相似的间隔序列（spacers）间隔排列组成。

CRISPR基因特点：

特点1 ：是一种重复的短的回文序列，长约20-40bp

特点2： 相同的序列间接重复，中间有间隔。这些间隔序列与一些病毒的序列存在同源性。

 

Cas

Cas:CRISPR associated 基因，CRISPR相关基因是靠近CRISPR基因座附近的一组高度保守基因群，其所编码的Cas蛋白，包含核酸内切酶、解旋酶以及与核糖核酸结合的结构域，能够识别外源DNA，通过位点特异性的切割将入侵DNA切断。

 

Q3：CRISPR-Cas系统是怎样工作的？

A：简单来说：当细菌感应到病毒DNA入侵时，细菌会产生两种RNA，这两种RNA会嵌入Cas蛋白中，即与Cas蛋白结合形成复合物，这一复合物可对病毒DNA进行特异切割。

复合物如下图：

小Q：两种RNA是谁呢？

A：这两种RNA为crRNA和tracrRNA。

***crRNA:

全称：CRISPR RNA

 

***tracrRNA:

全称： transactiving CRISPR RNA（转录激活crRNA）

 

补充说明：

tracrRNA是由Cas蛋白上游的互补链转录来的，具有一段能同crRNA上的重复序列互补配对的序列。

成熟的crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成特殊的双链RNA结构，指导cas蛋白在目标DNA上引起双链断裂。

 

 Q4：深入了解CRISPR-Cas系统

A：目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。

 

根据Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系统被分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型 CRISPR/Cas免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是被改造的最为成功的人工核酸酶。

CRISPR-Cas系统示意图：

***我们已经知道，CRISPR由一系列短的高度保守的正向重复序列（repeats）与长度相似的间隔序列（spacers）间隔排列组成。

 

***名词解释：

1.Leader sequence ：前导序列

位置：在CRISPR基因第一个重复序列的上游，大约200-500bp,充当CRISPR启动子的角色。

 

2.Repeats:长度约为21-48bp,为短回文序列。即可形成发夹结构。这里是Cas蛋白的结合区域。

 

3.Spacers：间隔序列。这些间隔序列与一些病毒的序列存在同源性，可以理解为是被细菌俘获的外源DNA序列，即细菌免疫系统的“黑名单”。

 

4.Cas9:

 

Cas9是由1409个氨基酸组成的多结构域蛋白，含有2个核酸酶结构域：氨基端的RuvC-like结构域及位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域，HNH核酸酶结构域可以切割与crRNA互补配对的模板链，切割位点位于PAM上游3nt处，RuvC-like结构域可以对另一条链进行切割, 切割位点位于PAM上游3~8nt处。在crRNA与tracrRNA形成的双链RNA的指导下，Cas9蛋白对靶位点进行切割。（PAM后边介绍）

 

Q5：PAM序列

要知道：

CRISPR靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白复合体和一个短DNA序列，这个短的DNA序列通常在靶DNA的3'末端作用，被称为PAM。

PAM：Protospaper Adjacent Motif

PAM为三个紧挨的碱基序列，最常用的为NGG三个碱基（N为任意碱基）。可帮助Cas9酶识别靶序列。

PAM决定着CRISPR/Cas系统切割发生的位点，CRISPR/Cas系统与目标DNA结合后，切割就发生在PAM上游的第三个碱基处。PAM位点突变后，CRISPR/Cas系统对DNA的亲和力降低。

 

 

 

 

Q6:再了解一遍CRISPR-Cas9技术

A：CRISPR-Cas9技术本质：

说人话：把Cas蛋白精确引导至特定的DNA位点上，并对这段DNA进行操作。

 

前面提到：成熟的crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成特殊的双链RNA结构，指导cas9蛋白在目标DNA上引起双链断裂。

根据这一原理，科学家创造出一个简易的CRISPR系统：cas9蛋白+gRNA

gRNA(guideRNA,即向导RNA)：tracrRNA和crRNA复合体。

 

gRNA会靶向病毒的基因组。cas9将复合物将切割靶向位点从而使病毒失去感染能力。

研究这发现这个系统不仅可以切割病毒DNA，而且能切割任何选定的序列位置，这可以通过对不同的靶位点设计特异的gRNA来实现。而这不仅可以在体外进行，也可以在活细胞的细胞核中进行。

 

 

Q7：最后顺一遍流程：

[当细菌感应到被病毒DNA入侵后，它就会产生两种短RNA。其中一个短RNA与入侵病毒的DNA相匹配，之后，这两个RNA（gRNA）与cas9蛋白形成复合物。gRNA会靶向病毒的基因组。cas9复合物将切割靶向位点从而使病毒失去感染能力。]

 

即：cas9简单理解为一种核酸内切酶，匹配上的这段序列被称为gRNA。一旦进入在细胞核中，该复合物会锚定在一个被称为PAM的短序列上，cas9会将DNA解螺旋，之后，DNA会与靶RNA相结合。如果碱基完全匹配，cas9蛋白则会对DNA进行切割。当切割发生后 ，细胞会试图对切口进行修复，但是这种修复容易出错，由修复产生的突变会使基因失活。

最后，该基因沉默。