空间代谢组学（空间质谱成像）如何联动揭秘真皮纤维细胞异质性？
前言
人类真皮成纤维细胞是皮肤的细胞成分，由于自身特性表现出细胞间的表型异质形态。单个真皮成纤维细胞可以有不同的细胞特性，负责伤口修复、细胞外基质改变、纤维化或重塑等功能。而不同表型的成纤维细胞的脂质代谢及脂质成分是否参与成纤维细胞亚型的建立尚不清楚。研究真皮成纤维细胞的总体脂质组成和表型状态，以寻找脂质在确定真皮成纤维细胞身份中的可能作用是尚待解决的难题。
本篇由瑞士洛桑联邦理工学院Gioele La Manno和Giovanni D’Angelo教授/课题组在Science期刊发表的题为 “Sphingolipids control dermal fibroblast heterogeneity ”（IF：63.714）的研究成果，通过高分辨率质谱成像、单细胞转录组学、RNA测序技术等研究方法，以人真皮成纤维细胞（dHFs）为研究的对象，发现了人真皮成纤维细胞（dHFs）的特征，探究了真皮成纤维细胞的异质性机理，描绘了真皮成纤维细胞的脂质和转录图谱。为研究真皮成纤维细胞的脂质组成、转录和表型状态提供了理论依据。
研究思路
研究方法
1. 实验分组/研究材料
原代真皮人成纤维细胞（dHFs）
2. 技术路线
2.1 空间代谢组学和单细胞转录组学：分析人成纤维细胞
2.2 ESI-LC/MS和MRM：生成dHFs质谱图像、评估脂质变异性、单像素分析
2.3 scRNA-seq：dHFs RNA测序
3. 统计分析
PCA分析、皮尔逊相关系数
研究结果
1. 空间代谢组学揭示了脂质异质性的组织原理
原代真皮人成纤维细胞（dHFs）进行空间代谢组学分析（图1A），从原始数据中提取脂质图像。通过电喷雾电离液相色谱-质谱（ESI-LC）和基于多反应监测（MRM），可获得脂质图像（图1A-B）。主成分分析（PCA）描绘了不同脂质组的不同分布模式（图1C）。部分仅显示正像素或负像素，与PC1、PC2至PC8的观察结果相反，属于鞘脂途径的脂质（图1D）。dHFs中存在两个共存的脂质变化轴，一个轴与细胞内组织有关，另一个轴则与脂质相关的细胞间异质性有关。
图1 | dHFs的单像素空间代谢组学分析
2. 单细胞分析揭示脂质协同调节
光学图像指导细胞分割，转移到MS图像上，可获得三个独立高分辨率质谱成像数据记录的257个单细胞脂质（图2A）。通过计算变异系数（CV），总结整个细胞群中与单个脂质种类相关的细胞间变异性，鞘脂途径具有较高的细胞间变异性（图2B）。脂质-脂质相关性（皮尔逊R）矩阵，测试鞘脂代谢途径是否被协调调节，或在不同细胞中不同的鞘脂亚群是否被独立控制（图2C）。单细胞脂质体根据脂质组成，形成不同的细胞簇，并观察到某些物种（即Cers、HexCers、Gb3s和Gb4s）在特定细胞簇中富集，表明dHFs存在于不同的鞘脂代谢状态中（图2D-F）。
图2 | 单细胞脂质组学分析
3. 鞘磷脂定义dHFs脂肪类型
采用荧光标记的细菌毒素可识别不同的鞘脂头基。毒素染色的dHFs可由空间代谢组学观察到（图3A），通过空间质谱成像技术，ShTxB1a染色与Gb3水平相关性最好，ShTxB2e染色与Gb4和Gb3水平相关良好（图3B）。分析四个不相关的dHFs，表现出类似的细胞间鞘脂变异模式，表明细菌毒素捕获细胞间鞘磷脂的异质性，且不同个体的dHFs也存在鞘脂异质性。dHFs存在于不同的脂质代谢构型中，并涉及细胞大小、不同细胞表型形状及不同的内吞和分泌状态（图3C-D）。
作者通过模型预测ShTxB1a+/2e+、ChTxB+和triple+细胞在单细胞复制周期（21小时）中，分别有37%、51%和68%的概率转化为不同的脂质结构（图3E-G）。实验证明，ShtxB1a+和ShtxB2e+状态则更为短暂，并显示出转化为ShtxB1a的更大倾向（图3J）。FACS选择ShTxB1a+或ChTxB+细胞并通过细胞培养，细胞培养物恢复为具有与最初选择细胞相似的脂质状态组成的异质细胞群（图3K）。基于这些结果，表明dHFs存在于亚稳态鞘脂代谢构型中（图3L），并在细胞世代中持续存在。
图3 | 空间代谢组和毒素染色鉴定dHF脂肪类型
4. 脂质类型标记特定的细胞转录状态
单细胞转录组测序dHFs，识别了17个细胞簇（图4A）。这17个集群被分为六类：增殖、促炎细胞因子分泌（炎症）、促纤维化分泌（纤维化）、细胞外基质重塑（纤维化）和促血管生成因子分泌（血管）（图4B），炎症、纤维化和纤维化分别代表相互替代的转录细胞配置（图4C-D）。
FACS根据dHFs的脂肪类型分离dHFs，并分离出ChTxB+、ShTxB2e+、ShTxB1a+/2e+和triple+细胞（图4E）。不同脂肪类型的高表达映射到不同区域（图4F-G），triple+细胞对应单细胞转录组的炎症、纤维溶解性和血管成纤维细胞，表明特定的脂肪类型与普遍细胞状态相关（图4H）。将dHFs与不同簇的毒素和标记物进行比较，显示ChTxB和平滑肌肌动蛋白阳性细胞之间、ShTxB2e和层粘连蛋白a阳性细胞之间存在特定的重叠。说明，脂肪类型是dHFs细胞状态的标志物（图4I-J）。
图4 | 脂肪类型映射转录细胞的状态
5. 脂质类型标记体内特定dHF群体
真皮深层区域的成纤维细胞具有成纤维活性，乳头状成纤维细胞具有更大的增殖能力。两者的dHFs的转录特征映射到UMAP，并有区域重叠现象（图5-B）。ChTxB+细胞出现在网状真皮区域，ShTxB1a+/2e+细胞主要出现在乳头状真皮区域（图5C）。成纤维细胞标志物波形蛋白和其他真皮标志物的染色证实，dHFs被毒素染色后具有不同的特异性（图5D）。
皮肤受损时，如受伤或癌症损伤，皮肤成纤维细胞被激活并经历表型转换，表明ChTxB+细胞是癌症相关的成纤维细胞（CAF）（图5F）。CAF主要是ChTxB+和ShTxB1a–/2e–（图5G-H），dHFs脂肪类型由分布在不同皮肤区域的成纤维细胞亚型反映，与皮肤癌有不同的关联。
图5 | 脂质类型定义皮肤中的dHFs群体
6. 鞘磷脂成分影响细胞状态
单细胞鞘脂组成由转录后的机制决定。脂质类型与细胞状态相关，但细胞状态没有赋予转录程序，不能解释脂肪类型。通过Cer合成酶抑制剂FB1治疗dHFs，会阻断鞘脂的产生。当FB1处理的dHFs与对照细胞整合在相同的转录嵌入中时，表现出不同的分布状态（图6C）。FB1治疗剥夺了细胞的鞘脂，通过表达（OE）细胞显示鞘脂组成的预期变化，GM3S-OE dHFs主要由ChTxB+细胞组成，Gb4S OE dHFs主要由ShTxB1a+/2e+细胞组成（图6E）。scRNA-seq分析GM3S-OE和Gb4S OE系，测试脂质类型变化对细胞状态的影响。Gb4S OE细胞显著下调，纤维溶解和炎症标记物MMP-1和CCL2在Gb4S OE细胞中上调，GM3S-OE细胞下调（图6 F- G）。
图6 | 鞘脂扰动对细胞状态的影响
7. 鞘脂整合到调节回路中参与细胞状态测定
FB1引发的转录变化涉及FGF2激活和TGF-b靶点的抑制。TGF-b上调基因，TGF-b下调基因。FGF2在对照细胞和成纤维细胞群中有更多表达。dHFs受到FGF2或TGF-b攻击时，鞘脂耗竭不会抑制成纤维细胞对TGF-b的反应，而会增加细胞对FGF2的敏感。此外，FGF遗传信号中断通过DNFGFR1表达，并显著减弱对FB1的转录反应（图7A-C），表明鞘脂诱导的转录变化需要FGF信号。
转录反应细胞鞘脂组成的变化也需要FGF信号（图7D-E）。暴露在Gb3和Gb4的dHFs比暴露在GM1的dHFs更容易受到FGF通路激活的影响（图7G）。鞘脂可调节FGF2信号，FGF2信号通过维持替代代谢途径来对抗GM1的产生，而促进Gb3和Gb4的产生（图7H-I）。
图7 | 鞘脂扰动对FGF信号的影响
研究结论
文章探究了真皮成纤维细胞（dHFs）的异质性，研究脂质代谢的细胞身份。考虑到脂质的普遍存在及其结构多样性，期待发现其他的细胞类型。研究的一个局限性是是无法处理脂质和转录轨迹的活细胞和单细胞。时间分辨数据，可能阐明脂质代谢通量在单元状态转变期间的演变。通过高分辨率质谱成像技术与单细胞转录组学技术，细胞间的异质性脂质代谢在多细胞系统的自组织中具有指导作用。
研究通过单个细胞的脂质组成，发现脂质在确定细胞状态中起着驱动作用。特定的脂肪类型影响了信号受体的活性，脂质重塑可能在早期建立了细胞身份的驱动因素，及跟踪单个细胞的脂质代谢轨迹。研究激发了关于脂质在细胞中的新问题，探寻脂质在决定真皮成纤维细胞的细胞身份方面可能发挥的作用，并为多细胞系统增加了新的调控成分。
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本文通过将高分辨率质谱成像技术-空间代谢组学与单细胞转录组学相结合的方法，测量了人真皮成纤维细胞（dHFs）的脂质组和转录组。发现特定脂质代谢途径的细胞间变化，有助于与皮肤结构组织相关细胞状态的建立，并揭示了一种新的多细胞系统自组织调节成分。
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