作者︱王筱童 郑梅君 肖恺丰

来源︱Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛

果蝇是神经生物学研究中重要的模式生物，其具有神经系统结构简单、培养简便、生长周期短等诸多优势。此外，果蝇具有丰富多样的行为模式，这一特性使得其被广泛用于神经系统调控行为的研究中。1960年Benzer实验室开发了一系列果蝇行为学实验范式，用于睡眠节律等多种行为相关调控基因的研究[1]，这开创了果蝇用于行为学研究的先河。在此后的研究中，各大实验室也开发了多样的行为学实验范式。如今，已有丰富的行为学实验范式用于研究果蝇的进食、求偶、睡眠、打斗等本能行为，以及学习记忆、决策等复杂行为。

在果蝇的进食行为中，存在多个不同阶段，其中具有多样的神经调控机制。一个完整的进食过程存在六个阶段，分别是觅食、靠近食物、进食起始、食物消化、进食终止，最后远离食物。为了研究神经环路如何影响进食行为的各个阶段，已有染料法检测进食量[2]、毛细玻璃管CAFÉ法检测进食量[3]、FlyPad检测果蝇进食频率[4]、dFRAME监测果蝇进食活动性[5]等多种方法。与此同时，除了上述对进食过程的量化实验外，对果蝇感受食物线索后做出进食决策能力也存在着相关的成熟行为学范式，即本视频所呈现的果蝇展吻反射（Proboscis extension reaction, PER）范式。

在PER范式中，被固定的果蝇会对反复呈现于其口器上的液体食物线索进行反馈，即是否伸展吻部继续进食。这一伸展吻部的过程被称为展吻反射。果蝇产生展吻反射的次数可以用于量化果蝇对食物的喜好程度或进食欲望。这一范式操作相对简单，并能与光遗传学等多种神经元操控工具相结合，实现对果蝇进食决策中各神经元功能的研究。

一、实验样品与试剂仪器

1. 样品信息

果蝇：本实验采用野生型w1118果蝇；在实际实验中，可使用其他转基因果蝇。

2. 试剂和耗材

耗材：1000 μL吸头一支，200 μL吸头若干，尖头棉签或滤纸条，脱脂棉，纱布，刀片，尖头镊子，长塑胶软管，太空沙板或其他软板，湿盒，果蝇固定手柄。

试剂：琼脂粉，面包酵母。

3. 仪器和软件

仪器：体视镜一台，用于果蝇的显微操作和观察。

软件：GraphPad Prism 8用于数据统计与作图。

二、实验操作

1. 果蝇的预处理

1.1 配制琼脂食物：将1 g琼脂粉融化于100 mL蒸馏水中，充分煮沸后倒入小管内，冷却凝固后备用。

1.2 饥饿果蝇：将果蝇倒入琼脂食物中饥饿，饥饿时长视实验条件及果蝇反应而定，一般为24-36小时。

2. 果蝇的固定

2.1 制作套管：取一根200 μL吸头，切去前端；夹取一小块纱布，用200 μL吸头的尾部将纱布推入大吸头中，并将1000 μL吸头前端切去约2 mm便于果蝇通过。

2.2 将果蝇转移头套在塑胶软管末端，塑胶软管另一端由操作者含入口中。将转移头插入果蝇饥饿管内，吸取单只果蝇进入转移头。

2.3 拔出转移头，轻轻吸气防止果蝇逃逸。

2.4 取一支200 μL吸头（后称固定头）套于转移头上，轻轻甩动吸头，使果蝇进入固定头

2.5 果蝇进入固定头后，将吸头微微立起并用力吹气，将果蝇卡到固定头前端狭窄位置至其无法移动。

2.6 将刀片放至果蝇胸节靠上的位置，接着轻轻吸气，让果蝇向后移动，并切去枪头尖端。

2.7 吹气，使果蝇牢牢卡在前，使果蝇头部完全露出。

2.8 切去固定头后节，只留前端5 mm - 1 cm左右。

2.9 撕一小块脱脂棉，用镊子轻轻推入固定头，注意塞脱脂棉时不要太用力。

2.10 固定完毕后，将果蝇竖直插入太空沙板或其他软板中，重复步骤2.2-2.9固定该组剩下的果蝇。

2.11 待整组果蝇都固定完毕后，将果蝇板放入湿盒中，在安静处避光恢复30-60分钟。

3. 检测

3.1 食物溶液的配制：本实验中采用10%的酵母溶液，将0.1 g酵母干粉与1 mL蒸馏水混合，使用涡旋振荡器完全混匀。

3.2 用镊子从软板上夹取一只果蝇，放置于可塑土手柄中（手柄使用可塑黏土制作，其前端刚好能够容纳固定头，从而防止固定头在板上滚动）

3.3 调整体视镜焦距至能清晰观察到果蝇，在镜下观察并调整果蝇位置，轻轻转动果蝇至其侧躺在板上，以清晰地观察到果蝇的口器伸缩。

3.4 使用尖头棉签或滤纸片蘸取蒸馏水，尽量平稳地靠近果蝇口器末端唇瓣，使果蝇伸出口器自由饮水。保持棉签平稳至果蝇不再饮水。

3.5 使用尖头棉签或滤纸蘸取酵母食物，轻轻靠近果蝇口器，与口器接触后迅速回撤，记录果蝇展吻情况（若不展吻，则将行为反应记为0；若展吻，则记为1）。连续进行10次刺激，计算果蝇的总展吻次数。注意，食物靠近果蝇口器后应立刻撤下，防止果蝇进食食物

3.6 重复步骤3.2 - 3.5，完成整组测试。

3.7 对行为反应指数进行分析、作图。

三、注意事项

在PER反应的记录中，应使果蝇的反应尽可能接近自然，因此需要保证固定时挤压果蝇力度较轻，湿盒内恢复适应时间足够长。

此外，在检测时，应将刺激局限于口器唇瓣上，避免让果蝇进食食物。这样可以排除肠道等复杂信号的调控，以及随着检测时间延长果蝇饱腹感的变化对实验结果的影响。

此外，提供可能出现问题的解决方案：

1. 提供食物后果蝇不产生PER反应：可以尝试延长饥饿时间，或检查食物是否有效。

2. 不提供食物也产生PER反应：首先考虑果蝇的个体差异，并考虑延长食物刺激间的间隔时间，确保每次刺激后都有三秒以上的时间令果蝇恢复反应。此外，食物气味也会影响果蝇的PER反应，尤其是酵母等含浓郁气味的食物可能会在靠近时直接引发展吻反应。为了避免食物气味的影响，可以在通风箱完成实验。

3. 果蝇的反应个体差异过大：首先考虑延长饥饿时间，使果蝇的饥饿水平达到同一程度。其次，考虑加快测试速度，从而使前后进行实验的果蝇有相似的反应最后，还可以在实验中穿插水刺激，若果蝇对水刺激有反应，则可以去掉该组数据。

四、结果分析

在实验记录中，对单只果蝇连续进行10次刺激，得到每只果蝇对应的总展吻次数，作为该果蝇的行为反应指数。若对单只果蝇给予多种食物刺激（如酵母和蔗糖），可对单只果蝇的不同反应进行配对T检验。

五、作者与导师简介

作者：

王筱童，中国科学院生物物理研究所脑与认知国家重点实验室李岩课题组直博二年级在读，课题内容主要关注果蝇进食相关信息由外周向中枢神经系统的输入机制，以及中枢整合神经环路的解析。

导师：

李岩，中国科学院生物物理研究所研究员，百人计划，博士生导师，脑与认知国家重点实验室课题组长。李岩研究组以果蝇为动物模型，涉及的研究领域和方法包括神经发育生物学、分子遗传学、学习认知行为的神经环路等。该研究组致力于以已有的行为范式为基础，探索高级脑功能的细胞分子机制，在认知、行为调控的神经环路和关键因子，及神经系统发育和疾病等领域开展了深入的、原创性的工作。

六、参考文献

1. Konopka, R. J., & Benzer, S. (1971). Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 68(9), 2112–2116.

2. Bai, X. B., et al. (2019). Blue Dye Assay to measure Food Consumption of Adult Drosophila under Different Nutrition Conditions. Bio-101: e1010266.

3. Ja, W. W., et al. (2007). Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(20), 8253–8256.

4. Itskov, P. M.,et al. (2014). Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature communications, 5, 4560.

5. Niu, M. X., et al. (2021). dFRAME: A Video Recording-Based Analytical Method for Studying Feeding Rhythm in Drosophila. Frontiers in genetics, 12, 763200.

Bio-protocol 简介                                 

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