USP1通过调节Snail稳定性关联铂金抗性与癌细胞传播
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今天推荐的是由意大利国家癌症研究所在2019年5月8日发表于Science Advances（IF：12.477，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Gustavo Baldassarre教授，研究表明USP1通过调节Snail稳定性关联铂金抗性与癌细胞传播。
研究背景
对铂类化疗的耐药性在癌症患者中非常常见，一般与肿瘤扩散和转移有关。铂金治疗本身是否会激活与肿瘤扩散有关的分子途径尚不清楚。
摘要部分
在这里，作者研究发现泛素特异性蛋白酶1（USP1）通过调节Snail的稳定性来介导卵巢癌细胞对铂金的抗性，而Snail又能促进肿瘤扩散。在分子水平上，观察到在铂金处理后，USP1被ATM和ATR磷酸化并与Snail结合。然后，USP1去泛素化并稳定Snail的表达，赋予其对铂金的抗性，增加干细胞样特征和转移能力。另一方面，USP1的基因敲除或药物抑制增加了铂金的敏感性，并以Snail依赖的方式减少了转移性传播。作者的研究结果确定了Snail是USP1的一个靶点，并为克服铂金抗性和更成功地治疗卵巢癌患者的新策略开辟了道路。
研究内容
1.USP1是OC细胞中铂金反应和干细胞样特征的关键媒介
为了确定OC细胞中铂金反应的新媒介，作者使用了基于短发夹RNA（shRNA）的功能缺失筛选确定了50个候选基因。然后在四个不同的OC细胞系中进行了验证性筛选，每个基因使用五个特定的shRNA。进一步的验证实验表明，USP1沉默使MDAH-2774细胞中的CBDCA半数最大抑制浓度（IC50）降低了约三倍。在CDDP（铂类化合物，包括顺铂）处理后，作者证实USP1沉默明显降低了所有测试细胞系的CDDP IC50。
除了在DDR途径中的作用外，最近的报告表明USP1在EMT和干细胞状态调节中的作用。作者观察到USP1的基因和药物失活降低了基础和CDDP诱导的与癌症干细胞表型相关的基因表达，包括KLF4、Sox2和c-Myc。此外，通常用于评估癌症干细胞特征的球状体形成试验显示，在未处理和CDDP处理的条件下，USP1沉默的细胞形成的球状体比对照细胞少，支持USP1在获得干细胞样表型中的作用。
此外，作者在三维（3D）Matrigel规避试验和体外间皮细胞清除试验中测试了对照组和USP1沉默的细胞，以模拟OC转移过程的最初步骤，并评估USP1在这方面的作用。USP1沉默的细胞显示出逃避三维基质的能力下降，也显示出附着、消化和侵入间皮细胞单层的能力。
研究结论：通过筛选发现USP1沉默明显降低了所有测试细胞系的CDDP IC50，USP1在调节CDDP敏感性和控制OC细胞的干细胞样和入侵特征方面具有关键作用。
2.USP1是CDDP处理的细胞中Snail蛋白上调的必要条件
EMT转录因子Zeb1、Snail和Twist-1促进了OC细胞对间皮的定植。一些研究表明，这些转录因子也被铂金治疗激活，并能控制化疗抗性。因此，作者观察到在CDDP处理的OC细胞中，Snail、Slug和Twist-1的表达大幅上调，但在所有测试模型中，只有Snail被CDDP持续上。USP1沉默减少了基础和CDDP诱导的Snail表达，而对Twist-1、Slug和Zeb1没有影响。使用USP1抑制剂SJB3-019A和匹莫齐特，无论是单独使用还是在CDDP处理后，都能观察到类似的效果，这证实了Snail表达的减少是USP1活性降低的直接结果。另一方面，通过时间过程分析表明，USP1和Snail的表达与DDR的激活同步。
研究结论：USP1是CDDP处理的细胞中Snail蛋白上调的必要条件，且USP1和Snail的表达与DDR的激活同步。
3.USP1去泛素化并稳定Snail蛋白
在USP1沉默后，Snail的mRNA水平没有变化，这表明蛋白质的下调是在转录后水平上控制的。此外，当用蛋白酶体抑制剂MG132处理时，USP1沉默的细胞显示出Snail的积累，这表明Snail可能受到蛋白酶体降解的调节。因此，作者假设USP1可能通过控制Snail的泛素化水平来调节Snail的表达，并观察到USP1很容易与Snail共沉淀，无论是在外源性还是内源性水平，它们的相互作用在CDDP处理中得到加强。USP1野生型（USP1WT），相比突变体USP1C90S，在转染了His-泛素的293T/17细胞中明显减少了泛素化的Snail的数量。
研究结论：Snail是一个新的USP1靶点。
4.Snail介导USP1对CDDP引起的细胞死亡的保护作用
除了众所周知的EMT诱导剂的作用外，Snail还被证明在一些癌症模型中介导铂金抗性。研究发现，Snail沉默增加了对CDDP的敏感性，并导致CHK1磷酸化的减少和H2AX表达的增加。与单独沉默USP1或Snail相比，联合剥夺USP1和Snail并没有导致细胞死亡增强。另一方面，在USP1沉默的细胞中过度表达Snail使CDDP在USP1沉默的细胞中的IC50增加了约五倍。
研究结论：USP1和Snail位于同一轴线上，而且Snail极大介导了USP1对OC细胞中CDDP敏感性。
5.USP1基因敲除的OC细胞对CDDP高度敏感，并且不能在CDDP的作用下上调Snail
作者观察到，USP1 KO细胞表达的Snail基础水平较低，并且在CDDP处理后未能上调Snail、KLF4和c-Myc。与USP1 WT相比，USP1KO细胞对CDDP处理更敏感，无论是在药物反应曲线还是在菌落试验中。此外，在基础条件下和用CDDP处理时，它们形成的球状体（卵巢球）较少，而且在三维Matrigel中的侵入性较低。这些USP1KO细胞的表型都能通过过量表达Snail而得到回补，这证实了Snail在CDDP处理后介导了USP1的作用。
研究结论：USP1基因敲除的OC细胞对CDDP高度敏感，并且不能在CDDP的作用下上调Snail。
6.ATM/ATR使USP1磷酸化，有利于USP1/Snail在CDDP处理下的相互作用
Snail 蛋白被激酶高度磷酸化，促进其降解或稳定，从而调节其半衰期。为了评估Snail的磷酸化是否介导了它与USP1的相互作用，作者从Snail/USP1转染的细胞中提取了蛋白质，磷酸酶处理仅略微降低了基础Snail/USP1的相互作用，但在CDDP处理后几乎完全阻止了它们的结合，这表明Snail、USP1或两者的磷酸化是必要的。
作者用一个抗PS/TQ抗体来评估可磷酸化的丝氨酸在CDDP处理后是否变得磷酸化。没有检测到Snail上的S/TQ磷酸化，而USP1在CDDP处理后S/TQ上有相当大的磷酸化。为了评估USP1的磷酸化是否由ATM/ATR直接作用，作者用CDDP结合ATM（Ku55933）和/或ATR（VE-821）的选择性抑制剂处理OC细胞并进行联合IP实验。ATM和ATR的联合抑制强烈地减少了OC细胞中内源性USP1的S/TQ磷酸化，并阻止了Snail/USP1的结合。此外，USP1的磷酸化对USP1介导的Snail的稳定很重要，因为抑制ATM/ATR会减少CDDP诱导的Snail蛋白上调。
研究结论：ATM和ATR对USP1的S/TQ磷酸化是USP1介导的Snail稳定性的一个关键步骤。
7.USP1在S42和S331上的磷酸化是其与Snail结合的必要条件
作者接下来利用基于质谱的蛋白质组学方法观察到，在基础条件下，USP1有四个丝氨酸被磷酸化，但只有S42的磷酸化在CDDP处理后强烈增加。为了证实这些数据，作者产生了抗PS42和抗PS331磷酸化特异性抗体，并在转染了USP1WT或双磷酸化突变体USP1S42A/S331A的OVCAR-8 KO细胞中测试其特异性。研究发现，S42和S331的磷酸化在CDDP处理的细胞中都有所增加，在MDAH-2774和OVCAR-8细胞的内源性USP1上也观察到同样的结果。
上述实验表明，ATM和ATR抑制剂强烈地减少了CDDP诱导的USP1S42磷酸化。因此作者认为S42 和/或 S331 磷酸化可能参与 USP1 与Snail 的相互作用。为了证实该设想，作者将USP1S42A、USP1S331A或USP1S42A/S331A突变体与Snail转染，并进行联合IP试验。作者观察到，当两个残基中的任何一个发生突变时，USP1与Snail的结合就会大大减弱。
研究结论：S42和/或S331的磷酸化参与USP1与Snail的相互作用。
8.USP1对OC细胞的转移性传播是必要的
OC患者的预后不佳，主要是由于出现了化疗耐药性疾病，并向腹膜和网膜以及位于腹腔的器官扩散。为了验证USP1是否通过稳定Snail在OC细胞的转移性传播中发挥了作用，作者利用OVCAR-8异种移植的腹腔内传播模型。为此，作者构建了OVCAR-8 USP1 KO细胞，稳定地重新表达USP1WT或USP1S42A/S331A。重新表达USP1WT可以调节Snail的表达，且无论是在基础条件下还是在CDDP处理后，都可以回补OVCAR-8亲代细胞的卵巢球形成能力。此外，在该细胞中沉默Snail，足以使卵球形成能力下降到与USP1 KO细胞相同的水平，证实Snail是该信号轴中USP1的关键下游目标。
为了验证这些体外表型是否转化为OC细胞在体内生长的不同能力，作者将构建的细胞及其参照细胞通过腹腔注射到雌性裸鼠体内，并通过宏观观察坏死和病理分析来评估肿瘤的扩散。注射USP1WT细胞的小鼠的肿瘤负担明显高于注射USP1 KO细胞或重新表达USP1S42A/S331A的细胞。综合宏观和病理分析表明，USP1 KOOVCAR-8细胞几乎完全不能生长，与体外观察到的卵球和三维Matrigel侵袭试验相类似。重新表达USP1WT的USP1 KO细胞有效地传播到小鼠腹部。这些表型与Snail的表达一致，与表达USP1S42A/S331A的细胞的肿瘤相比，Snail在肿瘤中的表达被下调，总体上证实了在体外观察到的情况。
为了验证Snail是否是体内USP1活性的关键媒介，作者在雌性裸鼠体内腹腔注射OVCAR-8 USP1 WT、USP1 KO和稳定过表达Snail的USP1 KO细胞（USP1KO + Snail）。Snail的过表达恢复了OVCAR-8USP1 KO细胞的生长和扩散到腹腔的能力。
研究结论：USP1通过调节Snail的基础表达和铂金诱导表达，可以作为一个有效的治疗靶标，以防止OC扩散。
9.USP1的高表达和活性预示着符合铂金治疗条件的患者预后不佳
为了验证USP1/Snail轴在人类病理学中的作用，作者首先分析了网上提供的KM Plotter数据集）。USP1的高mRNA水平预示着OC患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）较低。与作者观察到的USP1调节Snail蛋白的稳定性而不是其mRNA的表达一致，Snail mRNA的表达与患者的生存率没有关系。
接下来，作者在本院收集的OC患者（n = 10）的匹配原发和同步转移病灶中进行了USP1的免疫组织化学（IHC）分析。USP1在所有标本中都高度表达。由于无法通过IHC获得特异性染色，作者建立了一个 "对USP1抑制的反应性 "的试验，用CDDP±pimozide处理一组OC细胞系，然后通过Western blot分析Snail蛋白的表达。在10个测试的细胞系中的8个，作者称之为"反应者"，匹莫齐特阻碍了CDDP处理后Snail的上调表达。对CDDP±匹莫齐特处理没有反应的两个细胞系（"无反应者"）也对铂金后USP1沉默诱导的细胞死亡不敏感。
作者接下来在五个原生OC细胞系中使用了同样的检测方法。所有的原代细胞都表达了USP1，但只有三个细胞根据上述指定的标准被归类为反应者。因此，当作者用增加剂量的CDDP与匹莫齐特联合治疗原发性OC细胞系时，作者发现药物抑制USP1只在反应者细胞中表现出剂量依赖性的细胞毒性，证实USP1/Snail也影响了OC原发性细胞的CDDP反应。作者接下来探讨了与USP1活性相关的mRNA特征是否能预测OC患者的预后，并选择了该特征中10个上调幅度最大的基因。作者分析了KM Plotter数据集，并观察到这10个基因特征，比单独使用USP1表达的效果更好，能够分离出PFS和OS较差的OC患者。
鉴于上述结果，作者想知道这一特征是否可以作为铂金敏感性的一个更普遍的生物标志物，作者选择了乳腺癌作为模型。USP1和上述10个基因都能预测MDA-MB 468（TNBC）的PFS (progression-free survival)，但不能预测雌激素受体阳性（ER+）的BC，这证实了该标志物在检测符合铂金治疗的患者中具有较高的抗药性和疾病进展风险的稳健性。此外，在体外培养中，MDA-MB 468（TNBC），而不是MCF-7（ER+）细胞系，在CDDP处理时上调Snail，USP1的抑制损害了CDDP诱导的Snail的过表达，证明USP1/Snail轴在不同铂金敏感肿瘤的药物反应和细胞可塑性中起作用。因此，正如在OC细胞中观察到的那样，匹莫齐特增加了CDDP在TNBC细胞中的疗效，但在MCF-7细胞中没有。
研究结论：CDDP治疗后，一个癌细胞亚群以USP1依赖性的方式上调Snail，作为一种逃逸机制，导致铂金抗性和细胞存活率增加，最终增加转移性扩散和疾病复发。
结论与讨论
总之，作者展示了USP1在促进Snail介导的肿瘤侵袭和转移中的新作用。尽管目前USP1抑制剂和其他许多靶向疗法一样，没有高度的选择性，因此可能会产生脱靶效应，但作者在这里收集的数据有力地表明，在动物模型中，抑制USP1与铂类化合物相结合，可以提供一种有效增加铂类疗效的方式。鉴于临床需要克服OC患者和其他癌症患者的铂金耐药性, 作者相信这种联合疗法的临床测试在未来将迅速推进，以改善以铂金为基础的化疗后复发风险高的癌症患者的生存。
Thank you!
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aAV3235
