USP19通过自噬调控NLRP3功能抑制炎症并促进M2型巨噬细胞极化

写在前面

        今天推荐的是由中山大学生命科学学院在2020年8月23日发表于Cellular & Molecular Immunology（2020IF：11.530，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是JunCui教授，研究表明USP19通过自噬调控NLRP3功能抑制炎症并促进M2型巨噬细胞极化。

研究背景

        巨噬细胞极化为促炎M1型或抗炎M2型细胞对于建立宿主防御或修复组织至关重要。控制这一过程的确切分子机制仍然难以捉摸。

摘要部分

        在这里，作者发现泛素特异性蛋白酶19(USP19)作为抗炎开关，抑制炎症反应并促进M2型巨噬细胞极化。USP19通过增加自噬通量和减少线粒体活性氧的产生来抑制NLRP3炎症小体的激活。此外，USP19通过切割其多泛素链来抑制不依赖炎症小体的NLRP3的蛋白酶体降解。USP19稳定的NLRP3通过与IRF4直接结合促进M2型巨噬细胞极化，从而阻止其p62介导的选择性自噬降解。与这些观察结果一致，与WT小鼠相比，Usp19-/-在注射明矾和壳多糖后，小鼠M2型巨噬细胞极化减少，白细胞介素1β分泌增加。因此，作者发现了一种新的机制，通过该机制USP19将NLRP3的促炎功能转变为抗炎功能，并表明USP19是炎症干预的潜在治疗靶点。

研究内容

1.USP19缺乏促进了明矾诱导的腹膜炎的促炎反应     

        为了研究USP19是否通过体内自噬调节先天免疫反应，作者构建了USP19 KO小鼠。据报道，自噬可诱导PAMP（病原体相关分子模式）或DAMP（损伤相关分子模式）的清除以减轻炎症。为了揭示USP19在炎症中的作用，作者使用明矾诱导的腹膜炎模型，以检测IL-1β的产生。作者发现Usp19-/-与野生型（WT）小鼠相比，IL-1β显着增加。为了确定Usp19小鼠中IL-1β产生的增加是否与巨噬细胞募集增加有关，作者量化了灌洗液中的巨噬细胞。出乎意料的是，明矾处理后Usp19-/-小鼠中巨噬细胞的总数减少了。作者推断M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞之间的平衡可能在Usp19-/-小鼠中发生改变。事实上，作者发现M2型巨噬细胞（F4/80+CD11b+MR+）的比例，而不是M1型巨噬细胞（F4/80+CD11b+CD86+f）的比例在明矾处理后的Usp19-/-小鼠中减少。

        巨噬细胞极化与中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的募集密切相关。作者发现明矾诱导的中性粒细胞募集(CD11b+Ly6G+)在Usp19-/-中强烈增强。相反，Usp19小鼠对嗜酸性粒细胞（CD11b+Siglec-F+）的招募严重受损。因此，这些结果表明，在明矾诱导的腹膜炎模型中，Usp19-/-缺陷将抗炎反应转变为促炎反应。

研究结论：USP19缺乏促进了明矾诱导的腹膜炎的促炎反应。

2.USP19的缺失通过促进NLRP3炎性体激活增强了IL-1β的分泌

        鉴于USP19在明矾诱导的腹膜炎模型中显着抑制IL-1β的产生，作者认为USP19可能调节炎症小体的激活。作者从Usp19-/-小鼠中分离出不同的细胞类型，并检查炎症小体激活。Usp19的缺失显著增加了BMDMs、BMDCs和MEFs对ATP、明矾和硅石刺激的IL-1β释放。此外，相比WT小鼠，来自Usp19-/-小鼠的ATP处理的BMDM的上清液中裂解的caspase-1数量增加，表明Usp19缺乏确实增强了NLRP3炎性体激活。

        在炎症小体激活过程中，NLRP3通过PYD-PYD介导的相互作用触发ASC斑点的形成。在USP19-KOTHP-1细胞中，LPS和ATP诱导的THP-1衍生巨噬细胞中的ASC斑点形成显着增强以响应炎性体激活。活化的caspase-1裂解gasderminD蛋白以驱动细胞焦亡。作者发现NLRP3炎症小体激活后，细胞死亡在Usp19-/-中更为突出。没有观察到由AIM2介导的炎症小体激活而产生的差异。为了进一步证实USP19抑制NLRP3炎症小体激活，作者使用siRNA敲低WT和USP19-KOTHP-1衍生巨噬细胞中的内源性Nlrp3，并发现NLRP3的缺失消除了USP19-KO细胞中IL-1β的上调。

研究结论：USP19缺乏特异性地增强了NLRP3炎性体激活和细胞死亡。

3.USP19介导的自噬抑制ROS产生以抑制NLRP3炎症小体激活

        ROS是激活NLRP3炎性体的主要信号。为了确定USP19是否通过ROS产生影响NLRP3炎性体激活，作者探究了WT和Usp19巨噬细胞中的ROS积累。作者发现Usp19缺失在很大程度上增强了ROS的产生。此外，用线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO（一种线粒体ROS的特定清除剂）处理消除了Usp19-/-巨噬细胞中增加的IL-1β分泌。这些数据表明，USP19的缺失通过上调线粒体ROS的产生来增强NLRP3炎症小体的激活。     

        以前，作者表明USP19通过Beclin-1稳定促进自噬。为了研究USP19介导的自噬是否影响线粒体ROS的产生，作者敲除了Beclin-1，发现在没有Beclin-1的情况下，Usp19缺失所诱发的ROS的上调被减弱了。Beclin-1的缺失消除了USP19对IL-1β分泌的影响。

研究结论：USP19/Beclin-1的缺失会损害自噬，导致ROS产生增加并导致NLRP3炎症小体激活。

4.USP19的缺失损害了M2型巨噬细胞极化

        嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和Th2型CD4淋巴细胞分泌的IL-4可促进M2型巨噬细胞极化。作者用IL-4处理WT和Usp19-/-BM细胞，发现Usp19-/-细胞中M2型巨噬细胞相关标志物Il-10、MR和Ym1的表达明显减少，表明USP19在促进M2型巨噬细胞极化方面有内在的作用。腹膜中的壳多糖给药可以特异性地引导M2型巨噬细胞极化。因此，作者给小鼠腹腔注射壳多糖，发现从Usp19-/-小鼠获得的腹腔巨噬细胞，尤其是F4/80+CD11b+MR+巨噬细胞的比例降低。这一观察结果一致，作者发现来自壳多糖处理的Usp19-/-小鼠的PEC中M2型巨噬细胞相关基因Fizz1和MR的mRNA水平也降低。此外，作者发现Usp19-/-小鼠中壳多糖引发的嗜酸性粒细胞的数量也减少了。

研究结论：USP19对于响应壳多糖给药促进M2型巨噬细胞极化至关重要。

5.USP19抑制IRF4免受p62介导的选择性自噬降解     

        作者接下来试图确定USP19是否通过作用于M2型巨噬细胞的关键转录因子来促进M2型巨噬细胞极化。作者进行了放线菌酮（CHX）追逐试验并发现Usp19缺乏导致内源性IRF4的显着降解，而不是KLF4或STAT6。值得注意的是，与WT组相比，Usp19缺陷细胞中IRF4的降解速度加快。作者接下来观察到USP19的过表达增加了具有稳定NLRP3表达的293T细胞中的IRF4蛋白水平。鉴于USP19过表达没有改变IRF4 mRNA，增加的IRF4丰度发生在蛋白质水平。为了确定IRF4的哪个结构域被USP19稳定，作者用Myc-USP19共转染HEK293T-NLRP3细胞。免疫印迹分析显示USP19稳定了IRF4的C和N端结构域。有趣的是，作者发现USP19介导的IRF4稳定被自噬抑制剂完全抑制。这些结果表明USP19通过阻断自溶酶体或蛋白酶体途径来稳定IRF4。

        此外，作者将BM细胞置于自噬诱导条件下，包括饥饿和雷帕霉素处理，并发现IRF4蛋白水平降低。相比之下，自噬抑制剂阻止IRF4降解。作者检查了IRF4与不同受体的相互作用，发现IRF4与p62特异性相互作用。此外，作者发现IRF4在NH4Cl存在下与LC3B共定位。这些数据表明IRF4通过受体p62被招募到自噬体。接下来，作者剖析了USP19在IRF4稳定中的机制，发现USP19过表达损害了IRF4-p62关联。同样，在BM细胞中，作者还检测到p62和IRF4的内源性关联，并发现Usp19缺陷显着增强了p62和IRF4之间的关联。作者还发现USP19不能进一步稳定p62缺陷细胞中的IRF4蛋白。此外，作者在Usp19-/-BM细胞中重新表达小鼠Irf4并观察到小鼠Irf4的重新表达恢复了Usp19-/-BM细胞中IL-4诱导的M2型巨噬细胞极化。

研究结论：USP19通过抑制IRF4免受p62介导的选择性自噬降解来促进M2型巨噬细胞极化。

6.USP19通过NLRP3稳定IRF4

        为了研究USP19如何防止p62介导的IRF4降解，作者探究了USP19是否通过直接相互作用影响IRF4稳定性。然而，作者没有检测到USP19和IRF4之间的相互作用，这意味着USP19稳定IRF4的功能是间接的。NLRP3通过与患者中的IRF4作用而导致哮喘以及M2型巨噬细胞极化障碍是哮喘的主要原因。因此，作者检查了NLRP3在M2型巨噬细胞极化中的功能，并观察到NLRP3缺失降低了M2型巨噬细胞的比例，并减少了体内响应壳多糖的中性粒细胞的募集。作者进一步证实，在BM细胞中的IL-4刺激后，IRF4与NLRP3相关，并且IRF4的N末端对于IRF4-NLRP3关联至关重要。有趣的是，Usp19缺失通过影响它们的降解率降低了NLRP3和IRF4的蛋白质水平。此外，作者发现敲低NLRP3可以显着降低USP19诱导的IRF4积累。

研究结论：NLRP3可能在USP19介导的IRF4稳定中发挥重要作用。

7.NLRP3阻止p62介导的IRF4自噬降解     

        鉴于NLRP3和IRF4的蛋白质水平在WT和Usp19-/-细胞中相似。作者假设NLRP3与IRF4积累有关。作者收集壳多糖处理的WT和Nlrp3-/-PECs并发现Nlrp3缺失消除了IRF4积累。另一方面异位NLRP3表达强烈增加IRF4积累。此外，作者进行了CHX追逐测定并证明Nlrp3缺乏加速了内源性IRF4降解的速度。作者接下来发现自溶酶体抑制剂3-MA、CQ和NH4Cl单独稳定IRF4，而添加NLRP3并没有进一步稳定IRF4。作者还证明NLRP3不能进一步增加BECN1-KO细胞中的IRF4蛋白水平。由于IRF4仅与p62相互作用，作者检查了IRF4、NLRP3和p62之间的相互作用。数据显示外源NLRP3消除了IRF4-p62相互作用。这一观察结果进一步证实了Nlrp3缺乏显着增加了响应IL-4的IRF4-p62关联。最后，作者表明NLRP3不能进一步增加SQSTM1-KO HEK293T细胞中的IRF4蛋白水平。

研究结论：NLRP3通过阻断IRF4-p62相互作用来抑制IRF4降解。

8.USP19与NLRP3相互作用并使其稳定

        为了进一步确定USP19稳定NLRP3蛋白的分子机制，作者检查了它们的直接相互作用。在BM细胞中，内源性USP19和NLRP3直接相关，但它们的相互作用因炎性体激活而降低。这些数据意味着NLRP3掺入M1型巨噬细胞中的炎性体会减少其与USP19的结合，因此作者假设未掺入炎性体的NLRP3可能结合USP19并促进M2型巨噬细胞极化。事实上，NLRP3 R260W突变体，一种活性形式的NLRP3，在没有刺激的情况下直接触发IL-1β分泌，与WT NLRP3相比，结合USP19的能力降低。因此，USP19不能稳定NLRP3 R260W突变体。作者还发现在蛋白酶体抑制剂MG132、lactacystin和卡非佐米存在的情况下，USP19介导的NLRP3积累被消除，但自溶酶体抑制剂3-MA或CQ没有这种效果。此外，作者进行了CHX追逐测定并证明Usp19缺陷降低了内源性NLRP3的稳定性，但这种表型可以通过MG132处理减弱。

研究结论：USP19直接结合未掺入炎性体的NLRP3并抑制其蛋白酶体降解。

9.USP19在赖氨酸689处切割NLRP3的多聚泛素链     

        作者发现催化失活的USP19 C506S/H1157A突变体未能稳定NLRP3蛋白，表明NLRP3通过去泛素化而稳定。作者证实USP19缺乏显着增加了响应IL-4的NLRP3泛素化。进一步的实验表明，USP19特异性地剪切了NLRP3的K6连接的多聚泛素链，并且USP19的催化失活突变体未能剪切NLRP3的多聚泛素链。作者接下来试图确定NLRP3上的哪些赖氨酸(K)残基与这种修饰相关。使用计算机辅助算法，作者确定了NLRP3中的六个关键泛素化位点，并用精氨酸(R)替换它们以创建其对应的突变体。作者发现NLRP3中的K689是USP19介导的NLRP3积累所必需的。进一步的分析证实USP19不能进一步去泛素化NLRP3 K689R突变体。

研究结论：USP19在K689处剪切NLRP3的多泛素链并抑制NLRP3的蛋白酶体降解。

结论与讨论

        总之，作者证明了USP19如何塑造NLRP3在炎症发生和消退中的功能。在该模型中，一方面，USP19促进自噬，从而清除ROS并下调NLRP3炎症小体激活。另一方面，USP19通过去除K689上的多泛素链来稳定炎性体的NLRP3，并促进NLRP3与IRF4的相互作用，从而防止IRF4依赖p62的选择性自噬降解。由于巨噬细胞极化功能障碍与许多人类疾病有关，未来针对USP19的发展可能对炎症相关疾病具有治疗潜力。

Thank you!

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41423-020-00567-7