J Hematol Oncol | 乳腺癌类器官助力发现对抗三阴性乳腺癌化学耐药性的新策略

三阴性乳腺癌（TNBC）约占所有乳腺癌的 15-20%，由于雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2的缺失，患者无法从传统的内分泌治疗和HER2靶向治疗中获益。到目前为止，化学疗法仍然是新辅助和辅助环境中 TNBC 治疗的主要选择。最广泛使用的化疗药物，如多柔比星 (DOX)，通过诱导 DNA 链断裂或 RNA 代谢缺陷发挥其细胞毒性作用。然而多柔比星在大多数患者中最终会产生化学抗性，一旦出现化疗耐药，复发性疾病会迅速发展，这已成为治疗 TNBC 的主要障碍。因此，迫切需要确定新的治疗靶点以克服 TNBC 的化学抗性。

环状 RNA (circRNA)代表了一种新型的调控RNA，其特点是具有高度的进化保守性和稳定性。CircRNA 有望成为各种恶性肿瘤的潜在诊断生物标志物和治疗靶点。然而，circRNAs在三阴性乳腺癌（TNBC）中的调控功能和潜在机制在很大程度上是未知的。

2022年8月29日，山东大学杨其峰教授团队在 Journal of hematology and oncology 上发表题为 CircRNA-CREIT inhibits stress granule assembly and overcomes doxorubicin resistance in TNBC by destabilizing PKR 的研究文章，表明靶向circRNA-CREIT和SGs可以作为治疗TNBC化学耐药的有效策略。

伯桢生物现已有包含乳腺癌在内的超15种肿瘤类器官培养试剂盒，以及为了更好地保护珍贵的临床样本、提高原代组织建成率而研发的原代组织运输保存液。

首先，研究团队利用RNA测序分析了六对乳腺癌组织和相邻正常乳腺组织的circRNA转录谱，发现组间有108个差异表达的circRNA。其中circRNA-CREIT的表达在乳腺癌组织和配对的正常组织中表现出最显着的差异。通过ISH检测也证实了乳腺癌组织中circRNA-CREIT的显着下调。

接下来，将244名乳腺癌患者分为circRNA-CREIT高表达组和circRNA-CREIT低表达组。Kaplan-Meier 绘图仪证明 circRNA-CREIT 的高表达与良好的预后相关（图1F）。多变量分析显示，circRNA-CREIT是乳腺癌患者预后的独立预测因素。此外，较高水平的 circRNA-CREIT 与较低的病理分级、较低的淋巴结转移率和较小的肿瘤大小显着相关。然后他们检测了乳腺癌细胞系中circRNA-CREIT的表达，发现 TNBC 中的 circRNA-CREIT 远低于非 TNBC 亚型（图1G）。总的来说，他们推测circRNA-CREIT可能在乳腺癌的进展中发挥抑制作用，特别是在 TNBC 亚型中。

图1. CircRNA-CREIT 在 TNBC 中被下调

为了探索circRNA-CREIT在 TNBC 中的潜在作用，他们构建了circRNA-CREIT过表达质粒和三种不同的靶向连接区域的shRNA。首先，他们应用RNA-seq筛选 circRNA-CREIT 过表达细胞中的差异表达基因。差异表达基因的基因本体论（GO）分析和基因集富集分析（GSEA）表明，circRNA-CREIT可能与调节细胞对各种环境压力的反应密切相关，尤其是化学诱导的压力和细胞凋亡过程。接下来，他们在实验中使用DOX。通过进行qRT-PCR和ISH检测，他们发现circRNA-CREIT在化疗耐药的乳腺癌组织和多柔比星耐药的TNBC细胞（MDA-MB-231/DOXR）中显着下调。circRNA-CREIT过表达明显提高了TNBC细胞对DOX的化学敏感性，IC50值显着降低，而circRNA-CREIT表达水平降低则相反效果。菌落形成试验的结果与上述发现一致。此外，他们发现 circRNA-CREIT 过表达显着增强了 DOX 诱导的细胞凋亡，而 circRNA-CREIT 敲低导致细胞凋亡减少。

图2. CircRNA-CREIT显着增强了TNBC细胞在体外和体内的化学敏感性

为了评估circRNA-CREIT对体内肿瘤化学敏感性的影响，在雌性BALB/c裸鼠中构建了肿瘤异种移植模型。结果表明，在载体对照组和 DOX 处理组中，circRNA-CREIT 过表达显着降低了肿瘤生长速率和肿瘤重量（图2 F-H）。对Ki67和裂解的caspase-3进行免疫组织化学分析以检测异种移植肿瘤中的增殖率和细胞凋亡水平。在circRNA-CREIT过表达组中观察到增殖减少和细胞凋亡水平升高，尤其是在 DOX 处理组中。相反，circRNA-CREIT 敲低导致肿瘤生长加速、肿瘤对 DOX 的化学敏感性降低和细胞凋亡下调。

进一步，他们构建了一个患者衍生的类器官 (PDO) 模型，以检测 circRNA-CREIT表达与PDO 对DOX的敏感性之间的相关性。结果表明，具有较高 circRNA-CREIT 表达水平的PDO往往对DOX更敏感，并且具有较低的IC50值。

图3. CircRNA-CREIT 与 PKR 物理交互

为了阐明circRNA-CREIT影响化学敏感性的分子机制，他们进行了RNA pulldown分析，随后进行了电泳、考马斯蓝染色和质谱(MS)。在MS鉴定的蛋白中，PKR被确定为与circRNA-CREIT相互作用的候选蛋白(图3A)。然后用NPDock表明两分子之间的物理相互作用(图3B)。circRNA-CREIT和PKR之间的结合通过独立的RNA pulldown和免疫印迹试验进行验证(图3C)。并且通过构建代表三个不同茎环的三个截短的 circRNA-CREIT 探针，发现茎环2可以有效地拉下TNBC细胞中内源性的PKR蛋白。FISH联合免疫荧光(IF)检测显示内源性circRNA-CREIT和PKR在细胞质中共定位，进一步验证了circRNA-CREIT和PKR之间的直接相互作用(图3F)。为了确定PKR的哪个结构域负责与circRNA-CREIT的结合，他们构建了截断的PKR突变体(图3H)。RIP分析表明，在N端缺失 dsRNA 结合基序（dsRBM1-2）显着消除了 PKR 和 circRNA-CREIT 之间的相互作用(图3I)。

图4. CircRNA-CREIT 通过泛素-蛋白酶体系统促进 PKR 降解

接下来，他们研究了 circRNA-CREIT 对 PKR 表达的影响。他们发现与 circRNA-CREIT 过表达的影响相反，circRNA-CREIT 敲低增加了PKR蛋白的半衰期。因此，假设 circRNA-CREIT 在 PKR 降解中起重要作用。他们通过蛋白酶体抑制剂 MG132 处理细胞、co-IP 测定、WB实验，发现circRNA-CREIT通过K48连接的泛素-蛋白酶体途径介导 PKR 降解。并且通过生信分析以及MS结果，发现HACE1参与了 circRNA-CREIT 对 PKR 降解的调节作用。

图5. CircRNA-CREIT 增强了 HACE1 和 PKR 蛋白的结合

环状 RNA 可以通过充当该蛋白质及其 E3 连接酶的支架来调节下游蛋白质的降解过程。Co-IP分析显示 HACE1 过表达的细胞表现出增加的 PKR 泛素化，尤其是预期的 K48 连接的泛素化。并且Co-IP分析证实 circRNA-CREIT 增加了由 HACE1-Myc 沉淀的 PKR-Flag 水平。因此，circRNA-CREIT 作为支架可以将 PKR 和 HACE1 结合在一起，导致 PKR 降解增加。

图6. CircRNA-CREIT 通过 PKR/eIF2α 轴减弱 SG 的形成

根据之前的报道，PKR 是一种重要的激酶，可在丝氨酸残基 51 处磷酸化 eIF2α，并触发应力颗粒 (SGs)的形成。他们检测了circRNA-CREIT是否通过调节 PKR 表达发挥其作用。他们发现过表达circRNA-CREIT的TNBC细胞表现出比对照细胞显着降低的DOX的 IC50 值，并且这种效应可以被 PKR 过表达消除（图 6A）。此外，他们注意到circRNA-CREIT敲低和PKR 过表达在提高 TNBC 细胞中的DOX抗性方面发挥了协同作用。菌落形成分析也证实了上述发现，最后得出结论，PKR介导了circRNA-CREIT对TNBC细胞化学敏感性的影响。

考虑到 SGs 在癌症进展中的显着作用，特别是在增强癌细胞的耐药性方面，他们通过可视化 SG 标记蛋白 EIF3A、G3BP1 和 G3BP2，发现 DOX 处理可以有效地触发 SG 的形成。circRNA-CREIT过表达减弱了DOX处理下SG的形成，而这种作用被 PKR 过表达挽救了（图 6C）。相比之下，circRNA-CREIT 敲除显着增强了 DOX 诱导和缺氧诱导的SGs的形成。接下来，他们发现circRNA-CREIT 过表达显着降低了eIF2α的磷酸化，而 circRNA-CREIT 敲低促进了 TNBC 细胞中的 eIF2α 磷酸化。DOX 处理以时间依赖性方式触发eIF2α的磷酸化，并且这种效应可以通过 circRNA-CREIT 敲低来增强。此外，他们发现与 MDA-MB-231 细胞相比，DOX 可以在 DMDA-MB-231/DOXR 中诱导更高的p-eIF2α表达水平和更多的应激颗粒。因此，在TNBC细胞中DOX抗性与SG形成之间存在密切关系。

图7. ISRIB 与 circRNA-CREIT 在提高 TNBC 细胞的化学敏感性方面发挥协同作用

众所周知，小分子ISRIB可以有效地逆转eIF2α磷酸化的影响并触发SG分解。他们研究表明，circRNA-CREIT过表达载体和ISRIB的联合利用可以发挥协同作用，进一步提高TNBC细胞的药物敏感性（图 7A）。另一方面，ISRIB 显着挽救了由 circRNA-CREIT 敲低引起的化学抗性（图 7B）。菌落形成分析进一步证实了这些结果（图 7 C、D）。使用 DOX 抗性细胞也证实了 circRNA-CREIT 和 ISRIB 在逆转 DOX 抗性中的协同作用。为了检查ISRIB在体内化学抗性中的作用，他们将MDA-MB-231细胞皮下注射到雌性裸鼠中（图7E）。单独使用 DOX 或单独使用 ISRIB 治疗可以抑制体内肿瘤生长，而 DOX 和 ISRIB 的组合对减弱肿瘤生长具有显着的协同作用（图 7 F、G）。Ki67 和切割的 caspase-3 的 IHC 染色也验证了上述发现（图 7H）。结果表明，ISRIB是一种有前途的药物，可与化疗联合用于治疗 TNBC。

图8. CircRNA-CREIT 通过外泌体传播在 TNBC 中发挥肿瘤抑制作用

最近的研究表明，环状 RNA 可以被包装到外泌体中，并通过外泌体将耐药性传递给其他细胞。首先他们测试了circRNA-CREIT 通过外泌体传递发挥作用的可能性。然后他们使用circRNA-CREIT-外泌体处理的细胞中，观察到显着抑制细胞增殖和改善对 DOX 的化学敏感性（图 8 E、F）。此外，eIF2α的磷酸化水平被 circRNA-CREIT-外泌体下调，SG形成减弱。circRNA-CREIT-外泌体治疗组异种移植肿瘤的生长速度明显降低，这与 Ki67 和 cleaved caspase-3 的 IHC 染色一致，ISH检测证实与对照组相比，circRNA-CREIT 水平更高。此外，乳腺癌患者血浆中 circRNA-CREIT 的表达水平显着低于健康人，ROC（接受者操作特征）曲线下面积为 0.72。以上数据表明，circRNA-CREIT-外泌体是治疗TNBC的有效策略，circRNA-CREIT可以作为乳腺癌诊断的新型生物标志物。

总之，他们的研究揭示了 circRNA-CREIT 在调节SG形成和 TNBC 化学抗性中的关键作用。CircRNA-CREIT通过泛素-蛋白酶体系统增强 HACE1介导的PKR降解，从而抑制 PKR/eIF2α信号轴和SG形成。此外，circRNA-CREIT 可以通过外泌体传播并在TNBC细胞之间传播化学敏感性。临床上，circRNA-CREIT 在乳腺癌患者的 TNBC 组织和血浆中显着下调，且 circRNA-CREIT的高表达与良好的预后密切相关。此外，circRNA-CREIT的生物合成被DHX9 下调。总之，研究表明，circRNA-CREIT是乳腺癌诊断和预后的潜在生物标志物。靶向 circRNA-CREIT和SG形成可能是增强 TNBC 化学敏感性的有效策略。