细胞转染

①转染前进行细胞准备，在显微镜下观察细胞的生长状况，细胞密度在80%时，消化细胞。根据实验需要接种细胞，以24孔板为例，在每个细胞孔中接种 3×105个细胞，培养至细胞密度为50%～60%，即可进行转染。

②在超净工作台中放入完全培养基、Opti-MEM无血清培养基、Lipofectamine 3000、siRNA储存液、miRNA inhibitor、miRNA mimic等，紫外照射30 min。取2只1.5 ml无酶无菌EP管，标记为A、B管，以向24孔板的一孔转染siRNA为例。因为siRNA配置好后，要经过Lipofectamine 3000的包裹，才能被瞬时转染进细胞中，因此该操作一定要细致。向A、B管中各加入25 ul的Opti-MEM无血清培养基，一定要先加培养基。向A管中加入1.5 ul的 Lipofectamine 3000，再根据预先设计好的体系，注意滴加液体时缓慢轻柔，以免siRNA断裂，降低转染效率，向B管中加入2.5 ul的siRNA储存液。将B管液体转移至A管，注意轻柔缓慢滴加，上下颠倒，轻柔混匀，室温静置15 min，等待Lipofectamine 3000包裹siRNA。（siRNA和lipo3000的配比需要自己摸索）

③在此期间将24孔板从细胞培养箱取出，弃去培养基，向每孔中加入950 ul完全培养基（转染体系的补充用10%血清的完全培养基或无血清培养基等需要自己摸索）。待转染液静置15 min后，向每孔中缓慢轻柔滴加50 ul转染液，轻柔摇晃细胞板混匀液体，标注转染时间、转染体系、转染试剂名称等基本信息，放入37℃细胞培养箱。转染24小时后在显微镜下观察细胞生长状况，并更换培养基。（具体更换培养基的时间需要自己摸索）

④转染48小时后提取细胞总RNA，但不同的转染试剂效果不一致，细胞中RNA水平表达的时间不一致，根据具体情况确定，再进行qRT-PCR实验检测表达情况，计算siRNA转染后敲减效率，选择敲减效率高的siRNA进行后续实验。根据实验需要，确定后续实验的时间。如果下一步将进行蛋白免疫印迹法（Western Blot）、流式细胞术，则需要在转染后72小时进行。如果下一步将进行集落形成实验，则需要在转染后48小时进行。如果下一步安排transwell迁移和侵袭实验，则需要在转染后36小时到72小时内进行。如果下一步将进行伤痕划痕实验，则需要在转染后24小时到72小时内进行。

所有实验方法的时间、试剂配比需要根据自己的实验条件和目的以及细胞状态等自行摸索，本实验方法仅供参考。

本人保留一切权利，以上实验步骤仅供参考。